唾液腺組織幹細胞由来膵島移植と免疫調節モデルの開発

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ブタ唾液腺から内胚葉系幹細胞を樹立し、その細胞へブタインスリンプロモーターによりGFPを発現するようにレトロウイルスを用いて遺伝子を導入した。ごく少数の細胞は分化誘導前よりGFP陽性であったが更に多くの細胞をインスリン陽性細胞へ分化させる方法を検討した。ラット唾液腺由来内胚葉系幹細胞は細胞が隗をなして3次元に増殖すると、塊状になった細胞はよりインスリンを産生する。そのような条件を作り出すためにスフェロイドを形成させて培養を行った。またこのときGLP-1(10nMから50nM)や、20mA D-glucoseを加えて培養した。GLP-1添加は平板培養でも試みた。しかし、スフェロイドの形成やGLP-1添加、高糖濃度はインスリン産生細胞を強力に誘導しなかった。また、β細胞の再生を促すといわれているActivin Aとbetacellulinをそれぞれ2〜200ng/ml、0.5〜50ng/ml加えた培地で培養を試みた。しかし有意にインスリン産生細胞を誘導しなかった(RT-PCR法で確認)。そこで遺伝子を操作してインスリン分泌細胞を誘導できないか試みた。まず、幹細胞の自己複製やその後の細胞の運命決定に重要な働きをしているNotch-Hes系に着目した。ブタのHes-1の遺伝子配列を決定し、ブタ唾液腺由来内胚葉系幹細胞での発現をRT-PCR法で調べたところ、ブタ胎児全脳より明らかに強かった。一方、肝細胞分化誘導培養法で培養されたブタ唾液腺内胚葉系幹細胞は、約2週間培養すると細胞の形態が紡錘形から大型の正方形状へ変化し、Hes-1の発現はほとんど認められなくなった。以上よりHes-1の発現は幹細胞の維持に重要で、発現が減少することは細胞の分化を進めることに必要だと考えた。Hes-1の発現減少とブタ唾液腺内胚葉系幹細胞の分化について検討するためにsiRNA法を用いて唾液腺内胚葉系幹細胞でのHes-1のノックダウンを試みている。