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RNA干渉法を応用した椎間板再生療法の開発

RNA干扰法椎间盘再生疗法的开发

基本信息

批准号：
17659468
负责人：
土井田稔
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659468/
关键词：
椎間板変性遺伝子治療 RNA干渉超音波再生医療蛋白分解酵素 Fas-L

项目摘要

1)変性椎間板モデルの作成:ラットの尾椎の椎間板に創外固定器を装着し、持続的に圧迫させることで椎間板の変性モデルを作成した。1週間の持続的な圧迫により椎間板変性が起こることを組織学的に確認した。経時的に蛋白分解酵素(MMP-3)の発現を調べると、MMP-3遺伝子の発現が上昇していることが圧迫後2週より確認できた。2)RNA干渉を応用した内因性遺伝子の発現抑制実験RNA干渉方法を用いて椎間板変性に関連する負の要素(MMP-3,Fas-Lなど)の遺伝子の発現をブロックすることで変性椎間板の遺伝子治療への有効性を検討した。現在までに報告されているcDNA配列から標的とする遺伝子発現を抑制するためのsiRNAをデザインし、このsiRNAをコードするplasmidを作成、超音波コントラスト法により椎間板内に遺伝子導入した。次いで椎間板変性に関与していると考えられるMMP-3とFas-Lの発現を抑制するためにデザインしたsiRNAを導入した。SDラット尾椎椎間板の培養細胞にMMP-3遺伝子をブロックするために同じsiRNAをコードするplasmidを導入すると内在性MMP-3遺伝子の発現が特異的にdown regulateされたことが確認できた。一方、in vivoにおいてMMP-3をブロックするためのsiRNAをコードするplasmidを導入するもMMP-3遺伝子の発現はdown regulateされなかった。これは椎間板における内在性MMP-3の量が少ないためと考えられた。しかし、Fas-LをブロックするためのsiRNAをコードするplasmidを導入するとFas-L遺伝子の発現は有意にdown regulateされた。この結果からsiRNA法を応用してFas-Lの発現を抑制することにより、椎間板変性の進行を抑制させることができる可能性が示唆された。

1) The manufacture of the intervertebral disc: the external fixator of the intervertebral disc of the caudal vertebra is installed, the pressure of the disc is maintained, and the intervertebral disc is manufactured. 1 week of continuous stress, intervertebral plate differentiation, histological confirmation The expression of MMP-3 protein increased after 2 weeks of stress. 2)RNA interference is used to inhibit the expression of endogenous genes. RNA interference methods are used to investigate the effects of gene therapy on the expression of endogenous genes in intervertebral plates. We now report cDNA alignment, target gene expression inhibition, siRNA plasmid generation, and intraspinal gene introduction by ultrasound. The expression of MMP-3 and Fas-L was inhibited by siRNA. The expression of MMP-3 gene in cultured cells of SD rat intervertebral disc was specifically regulated by siRNA plasmid introduction and by the identification of MMP-3 gene. One side, in vivo, MMP-3 gene expression is regulated down by plasmid expression of siRNA. The amount of MMP-3 in the intervertebral plate is less than that in the intervertebral plate. The expression of Fas-L siRNA is intentionally regulated by plasmid induction. These results indicate the possibility of using siRNA to inhibit Fas-L expression and the development of intervertebral plate activity.