長期継代培養細胞を用いた視細胞イオンチャネル異常疾患研究のための実験系構築

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ヒト網膜芽細胞腫(Y79株とWERI-Rb-1株)においてnystaatin法による全細胞電位固定実験をおこない、イオンチャネルの同定を試みた。その結果、tetraetahylammonium (TEA)や4-anminopyridineに感受性を示す少なくとも2種類のK^+チャネル、テトロドトキシン(TTX)に感受性を示すNa^+チャネルnifedipineに比較的弱い感受性を示すCa^<2+>チャネルなど、いずれも膜電位依存性のイオンチャネルの存在が示唆された。RT-PCR法により、先天性停止性夜盲症(FSNB)における遺伝子変異が報告されているL型Caチャネルα「サブユニットの網膜アイソフォーム遺伝子(CACNAIF)が、少なくともmRNAレベルではヒト網膜芽細胞腫培養細胞にも発現していることを確認した。現在さらにα_2-、β_1-、β_2-、γ-およびδ-サブユニットの発現を検討中である。今後は、抗体をもちいたWestern blotの実験を進め、タンパクレベルでの発現も検討する。現在、CACNAIFについてsiRNAをいくつか作成し、そのノックダウンを試みている。十分な発現抑制を起すsiRNAが得られたら、特に上記のCa^<2+>チャネル電流の変化に注目した電気生理学的実験を進める予定である。さらに、CACNAIFをノックダウンしたのち、 FSNBにみられるいくつかの点突然変異を人為的に組込んだものを発現させ、電気生理学的特性を調べる。上記と並行して、同一の実験装置を用いウシ毛様体筋の単離細胞を短期培養したものにおいて、先に本研究グループの発見したムスカリン受容体刺激により開口する2種類の非選択性陽イオンチャネルおよびその開口調節に関わる信号伝達系の性質を詳細に検討した。その結果、これらのチャネルはM3型ムスカリン受容体からG_<q/11>を経て送られる信号に応じて開口することを示す見を得た。