胚性幹細胞を用いた腎前駆細胞の樹立および腎組織の再構築筑に関する研究

胚胎干细胞建立肾祖细胞及重建肾组织的研究

• 批准号: 18659300
• 负责人: 内山 聖
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659300/
• 关键词: ES細胞; 腎前駆細胞; WT-1遺伝子; WT1遺伝子; Sall1遺伝子

腎前駆細胞の培養法の開発WT-1遺伝子座に緑色蛍光遺伝子EGFPがノックインされたES細胞を樹立した。このES細胞による胚様体の細胞をコラゲナー用いて単離し、胎生13日から胎生16日までの後腎とコラーゲンゲルによる3次元共培養を数日行いEGEPの発現を示す細胞を得ることができた。このEGFPの発現を示す細胞をcell sortingにより分取しマウス腎皮膜下に移植して、2週後に腎組織に分化するか組織学的に解析した。しかしながら、糸球体あるいは尿細管様構造は認められず、形態学的に腎組織と考えられる組織は形成されなかった。EGFPの発現を示す細胞が腎前駆細胞であるならば、どのような分化段階にあるのか調べた。WT-1、Sall-1、Eya-1、Lim-1、Pax-2などの腎発生初期に働く遣伝子群の発現がみられるのみなのか、それとも、かなり分化が進んだ時期のWnt-4、nephrin、synaptopodin、aquaporin-1、aquaporin-2等の腎マーカー遺伝子がすでに発現しているのか、RT-PCRにより調べたところ、WT-1、Pax-2の発現が認められたが、他の遺伝子の発現は認められなかった。この結果腎発生初期に相当する腎前駆細胞の可能性が考えられた。次いで、腎前駆細胞の形質を失わずに継代増殖できる培養法を開発する目的で、Atalaらのウシ後腎細胞の培養法(Lanza RP, et al: Nature Biotech 20:689-696,2002)を参考にして試みたが、途中でWT-1、Pax-2の発現はoffになってしまい、腎前駆細胞の形質を失わずに継代増殖できる培養法を研究期間内に開発することはできなかった。腎前駆細胞の分化能の解析EGFPの発現を示す細胞を4週齢のマウス腎皮質に注入し、4週間後に腎臓を摘出して組織学的解析を行った。この解析では、X-gal染色により青色に染まる細胞は検出されず、EGFPの発現を示す細胞は、糸球体上皮細胞、血管内皮細胞、尿細管細胞などに分化する前に死滅したと考えられた。腎前駆細胞シートを用いたネフロンの再構築および腎組織再生の検討腎前駆細胞の形質を失わずに継代増殖できる培養法を開発できなかったので、この検討は実施できなかった。

Development of WT-1 gene locus for culture of renal progenitor cells and establishment of ES cells These ES cells are used in embryonic cell culture, and the development of EGEP in embryonic cell culture is demonstrated by cell culture at the 13th day of gestation and the 16th day of gestation. The development of EGFP was demonstrated by cell sorting and histological analysis of renal tissue after transplantation and 2 weeks The structure and morphology of renal tubule were studied. EGFP expression in prerenal cells is regulated by the differentiation stage. Wnt-4, nephrin, synaptodin, aquaporin-1, aquaporin-2, etc. were identified by RT-PCR, WT-1, Pax-2, etc. during the early stages of kidney development. The results showed that there was no significant difference between the early stage of renal development and the early stage of renal development. For the purpose of developing a culture method for the growth of renal cells after morphological loss of Atala cells (Lanza RP, et al: Nature Biotech 20:689- 696, 2002), reference was made to the development of WT-1 and Pax-2 during the study period. The expression of EGFP in renal cells was demonstrated by cell injection into the renal cortex at 4 weeks, and by histological analysis of the renal cortex at 4 weeks. This analysis shows that the cells in the human body, the endothelial cells in the blood vessels and the tubule cells in the urine have been destroyed before they are differentiated. The development of a culture method for the development of renal progenitor cells and the regeneration of renal tissue