Alport症候群のモデルマウスの作成および遺伝子治療法の開発

マウスCOL4a4のゲノム遺伝子において、NCドメイン部分を含む約3.5kbの断片を取り除き、この部分にneo遺伝子を組み込んだターゲテイングベクターを用いてジーンターゲティング法によりOL4a4ノックアウトマウスを作成した。NCドメインを含むcDNA断片を用いNorthern blotを行ったところ、ノックアウトマウス腎では、COL4a4の発現は認められず、NCドメインはノックアウトされていることが確認された。6種類のIV型コラーゲンα鎖のモノクロナール抗体を用いた免疫組織化学では、IV型コラーゲンα鎖4のみならず、IV型コラーゲンα鎖3および5も全く検出されなかった。また、IV型コラーゲンα鎖1および2は、コントロールでは主に糸球体のメサンギウム基質に限局して染まるのに対し、ノックアウトマウスでは染色範囲が拡大し、基底膜も明瞭に染まった。臨床症状は、血尿、蛋白尿が認められ、血中尿素窒素、クレアチニンは、生後10週頃より急激に増加し、大部分のノックアウトマウスは、生後13-16週頃に腎不全により死亡した。光顕および電顕所見もヒトAlport症候群の組織像と一致した。以上の解析より、本ノックアウトマウスは、ヒトAlport症候群のモデル動物に成り得るものと考えられた。本ノックアウトマウスを用いて遺伝子治療の可能性を検討した。CAGプロモーターを有するアデノウイルスペクターカセットpAxCAwtに全長のCOL4a4cDNAを挿入したコスミドpAxCOL4a4を用いてCOS-TPC法により組換えアデノウイルスを作成し、腎動脈に注入した。免疫染色では、IV型コラーゲンα鎖4が弱く染まる糸球体が少数認められたが、病理組織所見および尿所見では、遺伝子導入による有意な改善は認められなかった。糸球体に効率良く遺伝子導入する新しい方法の開発が必要と考えられた。

マウスCOL4a4のゲノム遺伝子において、NCドメイン部分を含む約3.5kbの断片を取り除き、この部分にneo遺伝子を組み込んだターゲテイングベクターを用いてジーンターゲティング法によりOL4a4ノックアウトマウスを作成した。NCドメインを含むcDNA断片を用いNorthern blotを行ったところ、ノックアウトマウス腎では、COL4a4の発現は認められず、NCドメインはノックアウトされていることが確認された。6種類のIV型コラーゲンα鎖のモノクロナール抗体を用いた免疫組織化学では、IV型コラーゲンα鎖4のみならず、IV型コラーゲンα鎖3および5も全く検出されなかった。また、IV型コラーゲンα鎖1および2は、コントロールでは主に糸球体のメサンギウム基質に限局して染まるのに対し、ノックアウトマウスでは染色範囲が拡大し、基底膜も明瞭に染まった。臨床症状は、血尿、蛋白尿が認められ、血中尿素窒素、クレアチニンは、生後10週頃より急激に増加し、大部分のノックアウトマウスは、生後13-16週頃に腎不全により死亡した。光顕および電顕所見もヒトAlport症候群の組織像と一致した。以上の解析より、本ノックアウトマウスは、ヒトAlport症候群のモデル動物に成り得るものと考えられた。本ノックアウトマウスを用いて遺伝子治療の可能性を検討した。CAGプロモーターを有するアデノウイルスペクターカセットpAxCAwtに全長のCOL4a4cDNAを挿入したコスミドpAxCOL4a4を用いてCOS-TPC法により組換えアデノウイルスを作成し、腎動脈に注入した。免疫染色では、IV型コラーゲンα鎖4が弱く染まる糸球体が少数認められたが、病理組織所見および尿所見では、遺伝子導入による有意な改善は認められなかった。糸球体に効率良く遺伝子導入する新しい方法の開発が必要と考えられた。