ユーイング肉腫マウスモデルの樹立と解析

前年度、サブクローニングした遺伝子をマウス胎性幹細胞(embryonic stem(ES)cells)に導入し、in vitroでの発現形式の確認を行った。その結果、2つのcell lineで2^<nd> reporter geneの発現(hPLAPの発現(アルカリフォスファターゼ染色で紫色に染色))を確認できた。そしてこれらPositiveなES細胞のcell lineをマウス受精卵に顕微鏡下に注入し、その受精卵を偽妊娠させたメスマウス子宮内に注入し、何とかキメラマウスを誕生させることに成功し、EWS/Fli1融合遺伝子を持つであろうトランスジェニックマウスを誕生させることができた。そして誕生したマウスの耳もしくは尾の切片よりDNAを抽出し、1^<st> reporter gene(βガラクトシダーゼ)の発現(LacZ染色)を確認したところ、どういうわけか発現を認めなかった。そのため、LacZ近辺のプライマーを作成してPCRを行ったところ、バンドを確認できた。次いでCreトランスジェニックマウス(pCX-Cre)とEWS/Fli1トランスジェニックマウスを掛け合わせ、EWS/Fli1の発現を試みたが、2^<nd> reporter gene(hPLAP)の発現が確認できなかった。同様にEWSFli1近辺でプライマーを作成してPCRを行ったところ、バンドを確認できた。さらにEWSFli1蛋白の同定を行ったが、バンドを認めなかった。つまりreportergeneおよびEWS/Fli1の遺伝子は共に存在するがサイレントジーンとなり、2ラインとも発現はしなかった。今後遺伝子発現させるべく、p53ノックアウトマウスとの交配などを検討し解析していきたい。あるいは別のアプローチで腫瘍発現マウスの作成に取り掛かりたい。

前年度、サブクローニングした遺伝子をマウス胎性幹細胞(embryonic stem(ES)cells)に導入し、in vitroでの発現形式の確認を行った。その結果、2つのcell lineで2^<nd> reporter geneの発現(hPLAPの発現(アルカリフォスファターゼ染色で紫色に染色))を確認できた。そしてこれらPositiveなES細胞のcell lineをマウス受精卵に顕微鏡下に注入し、その受精卵を偽妊娠させたメスマウス子宮内に注入し、何とかキメラマウスを誕生させることに成功し、EWS/Fli1融合遺伝子を持つであろうトランスジェニックマウスを誕生させることができた。そして誕生したマウスの耳もしくは尾の切片よりDNAを抽出し、1^<st> reporter gene(βガラクトシダーゼ)の発現(LacZ染色)を確認したところ、どういうわけか発現を認めなかった。そのため、LacZ近辺のプライマーを作成してPCRを行ったところ、バンドを確認できた。次いでCreトランスジェニックマウス(pCX-Cre)とEWS/Fli1トランスジェニックマウスを掛け合わせ、EWS/Fli1の発現を試みたが、2^<nd> reporter gene(hPLAP)の発現が確認できなかった。同様にEWSFli1近辺でプライマーを作成してPCRを行ったところ、バンドを確認できた。さらにEWSFli1蛋白の同定を行ったが、バンドを認めなかった。つまりreportergeneおよびEWS/Fli1の遺伝子は共に存在するがサイレントジーンとなり、2ラインとも発現はしなかった。今後遺伝子発現させるべく、p53ノックアウトマウスとの交配などを検討し解析していきたい。あるいは別のアプローチで腫瘍発現マウスの作成に取り掛かりたい。