X型コラーゲンプロモーター解析による軟骨細胞肥大化の分子メカニズム

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ヒトX型コラーゲンプロモーター領域の解析(プロモーターレポーターアッセイ、ゲルシフトアッセイ、クロマチン免疫沈降)により前年度までに転写開始点より80塩基上流に転写因子Runx2の結合領域(HY-box)を同定した。この領域はRunx2を導入しなくてもある程度の転写活性の上昇がみられるため、様々な因子に応答するuniversal enhancerと考えられた。そこで、この領域を4回タンデムにつないだ配列を蛍光レポーターベクター(Ds-red)に組み込んだコンストラクトをマウス軟骨細胞由来細胞株であるATDC5に安定導入し、肥大分化すると蛍光を発する細胞の作製に成功した。この細胞は実際にRunx2を導入することで、インスリン誘導下の培養にてより早く蛍光を発することが確認された。今後は、次年度に申請中の挑戦的萌芽研究「変形性脊椎症・関節症治療を目指した軟骨細胞肥大分化モニタリング法の確立と応用」の計画の如く、cDNAライブラリーソースを用いたレトロウイルス発現ライブラリーをこの細胞に導入して、肥大分化にかかわる新規分子のスクリーニングを行う予定である。さらに、新規分子の遺伝子改変マウスを作出して、新規因子の肥大分化に関わる機能をinvivoにも証明することを検討している。