多重蛍光可視化技術による組織改築と機能の解析

本研究課題の最終的な到達点は、メダカの心臓構成細胞にそれぞれ異なる蛍光蛋白質を発現させて1個体で多重蛍光から心筋組織構築を各細胞のみならず組織全体を生きたままで観察することである。心臓組織構成細胞のそれぞれを異なる蛍光で可視化するという手法は世界初であり、一個体で発生や臓器形成といったプロセスを生きたままで観察できることは、組織修復過程の観察にも有効である。多重蛍光組織可視化動物作製に先立ち各構成細胞特異的候補遺伝子の選定やプロモーター解析にあたり、現在までに蓄積された基礎データを用いて詳細に評価することは、本研究実現のプロセスで最重要項目である。平成19,年度研究では候補遺伝子の選定とそのプロモーター解析に取り組んだ。プロモーターの選択にあたり、心筋ではトロポニン、アクチン遺伝子、血管系ではFli 1遺伝子、神経系ではDBH遺伝子、赤血球ではグロビン遺伝子を候補とした。これら候補遺伝子のヒト、マウス、.ゼブラフィッシュの配列データを元にメダカゲノムデータベースでBLAST検索を行い、メダカホモログを予測した。予測された配列データを元に特異的プライマーを合成した。メダカの心臓から抽出したm-RNA群を鋳型とし逆転写酵素で合成したcDNAライブラリーから、各遺伝子をクローニングし、その配列を読んでメダカホモログを同定した。各遺伝子の特異的プロモーター領域があれば他種でのデータを参考にし、なければ上流1kb〜4kbと仮定し、メダカ尾部から抽出したゲノムDNAを鋳型として合成した特異的プライマーを使用しPCRで増幅し、複数候補のスクリーニングを試みた。それぞれのプロモーターに異なる蛍光レポーター遺伝子をつないだコンストラクトを作製するにあたりマイクロインジェックション装置を用いて受精卵にマイクロインジェクションすることで組織特異的な発現が期待できる候補プロモーターコンストラクトであるか検討した。マイクロインジェクションした受精卵で組織特異的発現が確認できたのは、Fli1、グロビンとなった。今後、更に候補遺伝子のスクリーニングを継続し、多重蛍光組織可視化動物作製に繋げたい。

本研究課題の最終的な到達点は、メダカの心臓構成細胞にそれぞれ異なる蛍光蛋白質を発現させて1個体で多重蛍光から心筋組織構築を各細胞のみならず組織全体を生きたままで観察することである。心臓組織構成細胞のそれぞれを異なる蛍光で可視化するという手法は世界初であり、一個体で発生や臓器形成といったプロセスを生きたままで観察できることは、組織修復過程の観察にも有効である。多重蛍光組織可視化動物作製に先立ち各構成細胞特異的候補遺伝子の選定やプロモーター解析にあたり、現在までに蓄積された基礎データを用いて詳細に評価することは、本研究実現のプロセスで最重要項目である。平成19,年度研究では候補遺伝子の選定とそのプロモーター解析に取り組んだ。プロモーターの選択にあたり、心筋ではトロポニン、アクチン遺伝子、血管系ではFli 1遺伝子、神経系ではDBH遺伝子、赤血球ではグロビン遺伝子を候補とした。これら候補遺伝子のヒト、マウス、.ゼブラフィッシュの配列データを元にメダカゲノムデータベースでBLAST検索を行い、メダカホモログを予測した。予測された配列データを元に特異的プライマーを合成した。メダカの心臓から抽出したm-RNA群を鋳型とし逆転写酵素で合成したcDNAライブラリーから、各遺伝子をクローニングし、その配列を読んでメダカホモログを同定した。各遺伝子の特異的プロモーター領域があれば他種でのデータを参考にし、なければ上流1kb〜4kbと仮定し、メダカ尾部から抽出したゲノムDNAを鋳型として合成した特異的プライマーを使用しPCRで増幅し、複数候補のスクリーニングを試みた。それぞれのプロモーターに異なる蛍光レポーター遺伝子をつないだコンストラクトを作製するにあたりマイクロインジェックション装置を用いて受精卵にマイクロインジェクションすることで組織特異的な発現が期待できる候補プロモーターコンストラクトであるか検討した。マイクロインジェクションした受精卵で組織特異的発現が確認できたのは、Fli1、グロビンとなった。今後、更に候補遺伝子のスクリーニングを継続し、多重蛍光組織可視化動物作製に繋げたい。