ヒト中鎖アシルCoA脱水素酵素cDNAの動物細胞における発現

人中链酰基辅酶A脱氢酶cDNA在动物细胞中的表达

• 批准号: 01480159
• 负责人: 八木 國夫
• 金额: $ 4.35万
• 依托单位: Institute of Applied Biochemistry
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• 财政年份: 1989
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1989 至 1991
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-01480159/
• 关键词: 中鎖アシルCoA脱水素酵素; 酵素活性欠損; 遺伝子異常; 培養線維芽細胞; cDNA; タンパク質合成; リポソ-ム; 分子遺伝学; mRN; タンパク合成; mRNA

中鎖アシルCoA脱水素酵素(MCAD)はミトコンドリアのマトリックスに存在し、脂肪酸のβ酸化の最初の反応を触媒するβ酸化系の律速酵素である。本研究ではこの酵素の異常による先天性代謝異常患者の遺伝子治療の開発を最終目標として、その基礎的成績を得ることを目的としている。昨年度に引き続き本酵素の遺伝子を患者由来の線維芽細胞に導入し、本酵素の発現効率の高い方法の開発を行った。導入に用いた本酵素の遺伝子はこの研究で単離に成功し、塩基配列を決定したヒト胎盤由来のMCADcDNAであり、細胞は本酵素活性欠損患者から採取した線維芽細胞で、本酵素のタンパクが検出されない細胞および不活性なタンパクが合成される細胞の2種である。昨年度に用いた方法では活性を示す本酵素の発現が極めて僅かであったので、用いるベクタ-を含めて種々検討し、今年度は東京大学宮崎教授によって作成された発現ベクタ-、pCAGGSに挿入した構築体を作成した。細胞への遺伝子の導入には先に開発したNー(αートリメチルアンモニオアセチル)ージドデシルーDーグルタメ-トクロライドおよびジラウロイルホスファチジルコリンとジオレオイルホスファチジルエタノ-ルアミンを膜成分とするリポソ-ムに遺伝子を包埋する方法を採用した。発現の有無についてはウエスタンブロットおよび免疫組織学的装色によるタンパクの生成およびHPLCを用いる高感度の定量法による酵素活性の測定の面から検討した。その結果、本法による遺伝子導入により欠損患者由来の線維芽細胞において正常細胞で認められる活性の2倍程度の発現をもたらしうることが明らかとなった。また昨年と同様に、M期同調剤であるTNー16あるいはデメコルシンを遺伝子包埋リポソ-ムと同時に細胞培養時に添加することがこのベクタ-による遺伝子導入にも有効であることを認めたが、その効果はCOS細胞の場合程顕著ではなかった。

Lock in ア シ ル CoA dehydrated vegetable enzyme (the direction of MCAD) は ミ ト コ ン ド リ ア の マ ト リ ッ ク ス に exist し, fatty acid acidification の beta の の the initial 応 を catalyst す る beta acidification is の law speed enzyme で あ る. This study で は こ の enzyme の abnormal に よ る metabolic abnormalities in patients with congenital の heritage 伝 son treatment の open 発 を ultimate goal と し て, そ の based performance を must る こ と を purpose と し て い る. Last year, に introduced <s:1> 続 に. This enzyme 's cultural heritage 伝 seed を was introduced from the patient' s source, the line of endothelial cells に, into the <s:1>. This enzyme has a <s:1> high activity rate <e:1>. The <s:1> method <e:1> developed を and った. Import に with い た traces of this enzyme の 伝 son は こ の research で 単 from に し success, salt base with column を decided し た ヒ ト placental origin の MCADcDNA で あ り this enzyme activity, cell は owe loss patients か ら take し た line d で bud cells, the enzymes の タ ン パ ク が 検 out さ れ な い cells お よ び not active な タ ン パ ク が synthetic さ れ る cells の two で あ Youdaoplaceholder0. Annual に yesterday with い た method で は を す indicated the active enzyme の 発 が now extremely め て only か で あ っ た の で, use い る ベ ク タ - contains を め て kind 々 beg し 検 miyazaki, our は "Tokyo university professor に よ っ て made さ れ た 発 now ベ ク タ -, pCAGGS に scions into し た build body を made し た. Cell へ の posthumous son 伝 の import に は に first 発 し た N ー (alpha ー ト リ メ チ ル ア ン モ ニ オ ア セ チ ル) ー ジ ド デ シ ル ー D ー グ ル タ メ - ト ク ロ ラ イ ド お よ び ジ ラ ウ ロ イ ル ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン と ジ オ レ オ イ ル ホ ス フ ァ チ ジ ル エ タ ノ - ル ア ミ ン を membrane composition と す る リ ポ ソ - ム に heritage 伝 son を embedding す る Method を uses た. 発 is の presence of に つ い て は ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト お よ び immune histology with color に よ る タ ン パ ク の generated お よ び HPLC を with い る Gao Gan degrees の quantitative method に よ の る enzyme activity determination の surface か ら beg し 検 た. そ の results, this law に よ る heritage 伝 son import に よ り owe damage of patients with origin の line d bud cells に お い て で normal cells to recognize め ら れ る active の double degree の 発 now を も た ら し う る こ と が Ming ら か と な っ た. ま た yesterday in と with others に, M phase coherent tonic で あ る TN ー 16 あ る い は デ メ コ ル シ ン を heritage 伝 son embedding リ ポ ソ - ム と に cell culture at the same time add す に る こ と が こ の ベ ク タ - に よ る heritage 伝 son import に も have sharper で あ る こ と を recognize め た が, そ の unseen fruit は COS cell の occasions 顕 cheng zhao で は な か っ た.

项目成果

Inagaki,T.: "Immunochemical and Molecular Analyisi of Mediumーchain Acyl CoA Dehydrogenase Deficiency" Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition. 8. 1-8 (1990)

Inagaki, T.：“中链酰基 CoA 脱氢酶缺乏症的免疫化学和分子分析”《临床生物化学与营养杂志》，8. 1-8 (1990)。

Inagaki,T.,Ohishi,N.,Tsukagoshi,N.,Udaka,S.,Ghisla,S.,and Yagi,K.: "Structually different rat liver medium-chain acyl CoA dehydro-genases directed by the complementary DNAs differing in the 5'ーregion" Biochimica et Biophysica Acta. (1990)

Inagaki, T.、Ohishi, N.、Tsukagoshi, N.、Udaka, S.、Ghisla, S. 和 Yagi, K.：“结构不同的大鼠肝脏中链酰基 CoA 脱氢酶由不同的互补 DNA 引导在 5-区域”Biochimica et Biophysicala Acta. (1990)

Inagaki,T.,Ohishi,N.,Bachman,C.,Ghisla,S.,Tsukagoshi,N.,Udaka,S.,and Yagi,K.: "Immunochemical and molecular analysis of medium-chain acyl CoA dehydrogenase dificiency" Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition. (1990)

Inagaki,T.、Ohishi,N.、Bachman,C.、Ghisla,S.、Tsukagoshi,N.、Udaka,S. 和 Yagi,K.：“中链酰基 CoA 脱氢酶缺陷的免疫化学和分子分析”