遺伝子組換えによる高リグニン分解性担子菌の作出

通过基因重组创建高度木质素降解的担子菌

• 批准号: 02454074
• 负责人: 諸星 紀幸
• 金额: $ 3.52万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 1992
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-02454074/
• 关键词: カワラタケ; ラッカーゼIII遺伝子; 遺伝子導入; β-エーテラーゼ遺伝子; PCR; サザンブロット; ラッカ-ゼIII遺伝子; 遺伝子組換え; βーエ-テラ-ゼ; 染色体DNAライブラリ-; ラッカ-ゼIII; 遺伝子解析; プロトプラスト

本年度の研究目標はカワラタケにおける安定した形質転換法の確立と形質転換体の遺伝子解析による遺伝子導入の確認と発現の検出である。まず,カワラタケの導入体として安定したプロトプラストが必要である。本実験ではサッカロースで浸透圧を調整し,OSSMY培地で培養すると,通常の1%NOVOZYMEとCELLULASE ONOZUKAの処理によって1〜2%の再生率を得た。また,組換え体のスクリーニングのためのG418の感受性レベルの実験では,プロトプラストの再生はGENETICINの濃度25mg/lで,カワラタケの菌系の生育は100〜150mg/lで抑制され,200mg/lで完全に抑制することが出来た。調整したプロトプラストをポリエチレングリコールを用いる常法により,形質転換した。導入プラスミドはpHN134で,これはG418に対する耐性を付与出来る性質を持つ。そこで再生されたG418耐性株がAΦ(G418耐性遺伝子)の導入による形質転換体であるかどうかを調べるために,PCR法とサザンブロットを行った。PCR法では数種の形質転換体に574bpの増幅したAHPI断片を見出すことが出来た。また,数種のG418耐性株にサザンブロットを行い,遺伝子導入の有無を検定した。プローブにはAPHIのXhoI〜HindIII 0.5Kbpの断片を用いたが,ハイブリダイズするバンドが認められた。これらの事実はG418耐性株にほぼ確かにAPHIが染色体に導入されていることを示している。他方,発現ベクターpLPTにligE(β-エーテラーゼ遺伝子)を挿入したpLPT-LEベクターを用い,カワラタケの形質転換体の作出を行った。まず,この遺伝子を保有しているかどうか確認するため,サザンブロット分析を行い導入を確認した。さらに発現を調べるため,形質転換体のβ-エーテラーゼ活性を調べたが検出されなかった。

The purpose of this year's research is to establish the method of morphological transformation, identify the gene introduction and detect the gene expression of morphological transformation. It is necessary for the introduction of new materials. In this case, the penetration pressure of OSSMY is adjusted, and the regeneration rate of OSSMY culture medium is usually 1% NOVOZYME and CELLULASE ONOZUKA treatment, which is 1 ~ 2%. In addition, the sensitivity of G418 to the growth of different strains was inhibited by 25mg/l GENETICIN, and the growth of different strains was completely inhibited by 200 mg/l GENETICIN. Adjust the quality of the product. The introduction of a new version of pHN134 and the introduction of a new version of G418 give rise to new properties. The introduction of AΦ(G418 resistant gene) into the G418 resistant strain by PCR was carried out. The PCR method was used to detect the 574bp amplified AHPI fragment in several types of DNA. In addition, several G418 resistant strains were tested for the presence or absence of gene introduction. The APHI's XhoI ~ HindIII 0.5Kbp chip is used in the plug, and it is also known as the Häibli Däibli Bänder. This is the case with the G418 resistant strain. On the other hand, it is found that the pLPT ligE(β- This is the first time I've ever seen a person who's been in a relationship with someone else. In addition, the quality of the substance is regulated.