単離胚盤葉細胞の注入による鶏生殖系キメラの作成に関する研究

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鳥類では標的遺伝子組換えの形質転換動物を作成するのに十分な初期胚操作技術が確立されていない。そこで、標的遺伝子組換え形質転換鳥作成法確立の為に、筆者が開発した窓開け受精卵を用いる初期胚操作法を、容易で効率良いキメラ作成法に改良することを目的とした。まず、種々のCa^<++>溶液で前処理し、色々な濃度のトリプシンを含む細胞単離溶液で回収した胚盤葉細胞の生存性、選択的接着性及びカドヘリン残存性を調べた。その結果、1mMCa^<++>を含む溶液で前処理し、低濃度トリプシンを含む細胞単離溶液で回収した鶏胚盤葉細胞は、細胞表面のカドヘリンの失活は抑制され、細胞の選択的接着性および細胞増殖能が著しく高いことが明らかになった。次に、放卵直後の横班プリマスロック受精卵からステージXの胚盤葉細胞を採取し、家兎血清を含むTCM-199培地に浮遊させ、これを24時間培養した。一方、ステージXの白色レグホン受精卵のやや鈍端よりの卵殻表面に7mm四方の枠を削り、卵殻を剥がした後、卵殻膜に5mm四方の窓を開けた。この窓を通して、マニピュレーターに装着したマイクロピペットを胚盤下腔に穿刺し、0.5μl,1500個の培養胚盤胞細胞を注入した。その後、卵殻膜付き卵殻で蓋をし、これを瞬間接着剤で固着させ、22日間孵卵し、生存率、孵化率、キメラ発生率、死亡時期のハンバーガー・ハミルトン・ステージの決定および死亡胚のアソモンドソンの体位の決定を行なった。培養0時間の胚盤葉細胞を用いた場合、平均孵化率は55.8%で、生存キメラ発生率は32.6%であった。しかし、12時間培養した胚盤葉細胞を用いた場合の生存キメラ発生率は2.5%で、24時間培養した胚盤葉細胞での生存キメラ発生率は0.0%であった。これらのことから、胚盤葉細胞は培養することにより速やかに全能性を失う事が明確にされた。また、本研究に使用された窓開け受精卵法は鳥類の初期胚操作法として極めて有効な事が明らかにされた。