BUdR,IUdR in vitro二重標識法による腫瘍細胞動態解析法の確立

BUdR、IUdR体外双标记法建立肿瘤细胞动力学分析方法

• 批准号: 05670757
• 负责人: 真里谷 靖
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Hirosaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05670757/
• 关键词: tumor cell kinetics; bromodeoxyuridire; iododeoxyuridine; potential doubling time; in vitro labeling

(1)HeLa細胞など数種類の培養細胞を用いて、iododeoxyuridine(IUdR)とbromodeoxyuridine(BUdR)の二重標識とモノクローナル抗体を用いた免疫組識染色(ABC法、APAAP^-法)による細胞動態解析法の基礎的検討を行った。この結果、一次抗体(BR3、IU4)の希釈率は250倍が適当であり、ABC法、APAAP法の発色基質はDABとFast Blue塩の組み合わせが良好であった。また、上記により得られた各培養細胞のpotential doubling timeは、log phaseでの倍加時間に近似していた。(2)ラット骨肉腫(POB)を用いて、in vivo標識(腹腔内投与)およびin vitro標識による結果の異同について検討した。in vivo標識では、ABC法、APAAP法の併用で解析できたが、in vitro標識では染色状態が不良のため、ABC法のみにより二枚の連続標本を用いて解析した。この結果、in vivo標識によるpotential doubling time とin vitro標識によるそれには、大きな差異はなかった。しかし、in vitro標識での染色状態(BUdR-BR3)は不安定であり、溶液中のBUdRあるいは染色過程での抗体(BR3)の濃度を変化させても明らかな改善は得られなかった。(3)免疫組識染色は、かなりtime consumingであることから、臨床応用を考える上でより実際的かつ迅速なflow cytometryによる解析の可能性についても平行して検討した。微量の臨床検体を用いることから、細胞のlossの少ない未固定法の導入、および混入する正常細胞(リンパ球、線維芽細胞など)除去のための抗サイトケラチン抗体の利用を試みた。この結果、培養細胞においては、界面活性剤添加ののち一次、二次抗体を添加していく未固定法の手技をほぼ確立した。また、phycoerythrin標識抗サイトケラチン抗体を作製することで、正常細胞を解析データから大部分除去することが可能となった。

(1) To investigate the basic cell dynamics analysis method of HeLa cell culture by double labeling with iododeoxyuridine(IUdR) and bromodeoxyuridine(BUdR) and immunohistochemical staining (ABC method, APAAP^-method). As a result, the yield of primary antibody (BR3, IU4) was 250 times higher than that of the control group. The combination of DAB, ABC and APAAP was good. The potential doubling time of each cultured cell was approximately equal to the log phase. (2)In vivo identification (intraperitoneal injection) and in vitro identification, differences and similarities in results are discussed. In vivo identification, ABC method, APAAP method and combination analysis, in vitro identification, staining state, ABC method and combination analysis This result, in vivo identification potential doubling time in vitro identification The staining state (BUdR-BR3) in vitro identification is unstable, and the concentration of antibody (BR3) in solution is changed during staining. (3)Immunohistochemical staining, time consuming, clinical use, feasibility of rapid flow cytometry analysis, parallel examination Microamounts of clinical samples were used to introduce, mix with and remove anti-tumor antibodies from normal cells (lymphocytes, fibroblasts) using the method of immobilization. The results, cell culture, surfactant addition, primary and secondary antibody addition, and immobilization techniques were established. Antibodies against the phycoerythrin are produced in the presence of normal cells and most of them are removed.