BUdR,IUdR in vitro二重標識法による腫瘍細胞動態解析法の確立

(1)HeLa細胞など数種類の培養細胞を用いて、iododeoxyuridine(IUdR)とbromodeoxyuridine(BUdR)の二重標識とモノクローナル抗体を用いた免疫組識染色(ABC法、APAAP^-法)による細胞動態解析法の基礎的検討を行った。この結果、一次抗体(BR3、IU4)の希釈率は250倍が適当であり、ABC法、APAAP法の発色基質はDABとFast Blue塩の組み合わせが良好であった。また、上記により得られた各培養細胞のpotential doubling timeは、log phaseでの倍加時間に近似していた。(2)ラット骨肉腫(POB)を用いて、in vivo標識(腹腔内投与)およびin vitro標識による結果の異同について検討した。in vivo標識では、ABC法、APAAP法の併用で解析できたが、in vitro標識では染色状態が不良のため、ABC法のみにより二枚の連続標本を用いて解析した。この結果、in vivo標識によるpotential doubling time とin vitro標識によるそれには、大きな差異はなかった。しかし、in vitro標識での染色状態(BUdR-BR3)は不安定であり、溶液中のBUdRあるいは染色過程での抗体(BR3)の濃度を変化させても明らかな改善は得られなかった。(3)免疫組識染色は、かなりtime consumingであることから、臨床応用を考える上でより実際的かつ迅速なflow cytometryによる解析の可能性についても平行して検討した。微量の臨床検体を用いることから、細胞のlossの少ない未固定法の導入、および混入する正常細胞(リンパ球、線維芽細胞など)除去のための抗サイトケラチン抗体の利用を試みた。この結果、培養細胞においては、界面活性剤添加ののち一次、二次抗体を添加していく未固定法の手技をほぼ確立した。また、phycoerythrin標識抗サイトケラチン抗体を作製することで、正常細胞を解析データから大部分除去することが可能となった。

(1)HeLa細胞など数種類の培養細胞を用いて、iododeoxyuridine(IUdR)とbromodeoxyuridine(BUdR)の二重標識とモノクローナル抗体を用いた免疫組識染色(ABC法、APAAP^-法)による細胞動態解析法の基礎的検討を行った。この結果、一次抗体(BR3、IU4)の希釈率は250倍が適当であり、ABC法、APAAP法の発色基質はDABとFast Blue塩の組み合わせが良好であった。また、上記により得られた各培養細胞のpotential doubling timeは、log phaseでの倍加時間に近似していた。(2)ラット骨肉腫(POB)を用いて、in vivo標識(腹腔内投与)およびin vitro標識による結果の異同について検討した。in vivo標識では、ABC法、APAAP法の併用で解析できたが、in vitro標識では染色状態が不良のため、ABC法のみにより二枚の連続標本を用いて解析した。この結果、in vivo標識によるpotential doubling time とin vitro標識によるそれには、大きな差異はなかった。しかし、in vitro標識での染色状態(BUdR-BR3)は不安定であり、溶液中のBUdRあるいは染色過程での抗体(BR3)の濃度を変化させても明らかな改善は得られなかった。(3)免疫組識染色は、かなりtime consumingであることから、臨床応用を考える上でより実際的かつ迅速なflow cytometryによる解析の可能性についても平行して検討した。微量の臨床検体を用いることから、細胞のlossの少ない未固定法の導入、および混入する正常細胞(リンパ球、線維芽細胞など)除去のための抗サイトケラチン抗体の利用を試みた。この結果、培養細胞においては、界面活性剤添加ののち一次、二次抗体を添加していく未固定法の手技をほぼ確立した。また、phycoerythrin標識抗サイトケラチン抗体を作製することで、正常細胞を解析データから大部分除去することが可能となった。