増殖細胞核抗原(PCNA)の多重免疫染色法の開発:抗原性の賦活化とその応用

固定や保存の条件によって影響を受けやすい増殖細胞核抗原(PCNA)とその他の重要な細胞や組織成分のマーカーとを組織の同一切片上で多重で免疫染色する方法を開発し、in situレベルでの増殖細胞の局在とそのフェノタイプの検索、他のマーカーとの位置的相互関係の解析を試みた。固定条件の設定:ラット各組織の凍結切片及びパラフィン切片を用いて、様々な固定条件下(固定液、固定時間とその温度など)におけるPCNA染色の比較検討をすると、パラフォルムアルデヒド系固定液でできるだけ短期間固定したもののみが染色性を示した。これに対して、より強い固定条件や、逆に未固定や通常のアセトン固定などでは全く染色できなかった。2.抗原性の賦活化(unmasking):上記の固定条件の中で、固定によりPCNAの抗原性が一度失われたものでも、賦活化を行うことにより、PCNAの免疫反応性が多少とも改善できる事がわかった。賦活化効果の最も強かったのは単純加熱やマイクロウェーブによる高温処理で、次いでペプシン処理がこれらに続いた。ただし、賦活化が強すぎるとバックグランド染色も強くなった。3.PCNAと他のマーカーとの多重免疫染色:各細胞の膜抗原やレセプター、細胞接着因子、ビメンチン、IV型コラーゲン線維などについても上記1と2の検索を同時に進め、それらの至適染色条件下において、PCNAとの多重免疫染色を行なった。以上のように、適切な固定条件と適度な賦活化を行なうことによって、従来から免疫染色の難しかったPCNAをはじめ、色々な抗原どうし間での多重免疫染色の可能性が見い出せた。現在、賦活化によるバックグランドを軽減するべく、賦活化の至適条件の検討を続けている。

固定や保存の条件によって影響を受けやすい増殖細胞核抗原(PCNA)とその他の重要な細胞や組織成分のマーカーとを組織の同一切片上で多重で免疫染色する方法を開発し、in situレベルでの増殖細胞の局在とそのフェノタイプの検索、他のマーカーとの位置的相互関係の解析を試みた。固定条件の設定:ラット各組織の凍結切片及びパラフィン切片を用いて、様々な固定条件下(固定液、固定時間とその温度など)におけるPCNA染色の比較検討をすると、パラフォルムアルデヒド系固定液でできるだけ短期間固定したもののみが染色性を示した。これに対して、より強い固定条件や、逆に未固定や通常のアセトン固定などでは全く染色できなかった。2.抗原性の賦活化(unmasking):上記の固定条件の中で、固定によりPCNAの抗原性が一度失われたものでも、賦活化を行うことにより、PCNAの免疫反応性が多少とも改善できる事がわかった。賦活化効果の最も強かったのは単純加熱やマイクロウェーブによる高温処理で、次いでペプシン処理がこれらに続いた。ただし、賦活化が強すぎるとバックグランド染色も強くなった。3.PCNAと他のマーカーとの多重免疫染色:各細胞の膜抗原やレセプター、細胞接着因子、ビメンチン、IV型コラーゲン線維などについても上記1と2の検索を同時に進め、それらの至適染色条件下において、PCNAとの多重免疫染色を行なった。以上のように、適切な固定条件と適度な賦活化を行なうことによって、従来から免疫染色の難しかったPCNAをはじめ、色々な抗原どうし間での多重免疫染色の可能性が見い出せた。現在、賦活化によるバックグランドを軽減するべく、賦活化の至適条件の検討を続けている。