キチナーゼとその類縁酵素の立体構造に基づく理論pKa値の計算と共通機能構造の推定

基于几丁质酶及相关酶的三维结构计算理论pKa值并估计常见功能结构

• 批准号: 14656043
• 负责人: 深溝 慶
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kinki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14656043/
• 关键词: キチナーゼ; pKa値; 触媒機構; 部位特異的変異導入

本研究では、キチン質加水分解酵素の触媒反応に必須な機能構造を、酵素の立体構造に基づく理論的pKa値の計算および部位特異的変異導入法によって明らかにすることを試みている。本研究の第一段階として、オオムギ種子由来のキチナーゼのX線結晶構造(2BAA)を基にして、すべての解離性アミノ酸残基のpKa値の推定を試みた。その結果、多くの解離性側鎖において、ほぼ正常なpKa値が得られたが、いくつかのアミノ酸残基、とりわけ、Arg114(>20.0)、Arg215(>20.0)、Glu203(-2.6)では、異常なpKa値が算出された。これらの異常なpKa値は、これらのアミノ酸残基の側鎖が他の側鎖と強い相互作用を行っていることを示すものであり、また、これらのアミノ酸残基の側鎖が触媒残基に近接して存在していることから、触媒反応にも関与していることが示唆された。以上の結果に基づき、まずArg215を部位特異的変異によってアラニンに置換させた変異体(R215A)の作製を試みた。部位特異的変異PCR法によって得られた変異遺伝子をEscherichia coli BL21(DE)pLysSに導入し、変異キチナーゼ遺伝子を発現させた。R215Aの酵素活性は完全になくなっており、Arg215が酵素活性発現に必須であることがわかった。R215AのCDスペクトルおよび蛍光スペクトルを野生型のものと比較すると、それぞれの強度は大きく減少しており、この変異によって大きな構造変化がおこっているものと思われた。熱変性実験を行い熱安定性を調べてみると、熱変性の転移温度は野生型に比べ、ほぼ6℃ほど低下していた。次にGlu203をアラニンに置換させた変異体を作製し、上と同様の解析を行った。この変異によって、酵素活性は完全になくなり、R215Aの場合と同様の構造変化がみられた。さらに熱変性の転移温度もほぼ6℃低下した。以上より、Arg215は触媒残基の近傍において、Glu203と相互作用を行うことによって、触媒残基のミクロ環境を適正なものに保っているものと思われた。

This study で は, キ チ の ン qualitative hydrolysis enzyme catalytic anti 応 に must を な function structure, enzyme の three-dimensional structure に base づ く pKa of the theory of numerical の computing お よ び site specific - different import method に よ っ て Ming ら か に す る こ と を try み て い る. This study first Duan Jie の と し て, オ オ ム ギ seeds origin の キ チ ナ ー ゼ の X-ray crystal structure (2) baa を base に し て, す べ て の dissociation sex ア ミ ノ acid residues の pKa numerical の presumption を try み た. From そ の results, much く の solutions side chain に お い て, ほ ぼ normal な pKa numerical が must ら れ た が, い く つ か の ア ミ ノ acid residue, と り わ け, Arg114 (> 20.0), Arg215 (> 20.0), Glu203 (2.6) で は, abnormal な pKa numerical が calculate さ れ た. こ れ ら の abnormal な pKa numerical は, こ れ ら の ア ミ ノ acid residues の strong side lock が he の side lock と い interaction line を っ て い る こ と を shown す も の で あ り, ま た, こ れ ら の ア ミ ノ acid residues の side chain が catalyst residue に nearly meet し て exist し て い る こ と か ら, catalytic 応 に も masato and し て い る こ と が in stopping さ れ た. Above の results に づ き, ま ず Arg215 を site specific - different に よ っ て ア ラ ニ ン に replacement さ せ た - variants (R215A) の cropping を try み た. Site specific - different PCR method に よ っ て have ら れ た - different heritage 伝 son を Escherichia coli BL21 (DE) pLysS に import し, - different キ チ ナ ー ゼ heritage 伝 son を 発 now さ せ た. The activity of the R215A enzyme is <s:1> complete になくなってお, and the activity of the Arg215が enzyme is に necessary である った とがわ った った った. R215A の CD ス ペ ク ト ル お よ び 蛍 light ス ペ ク ト ル を wild-type の も の と compare す る と, そ れ ぞ れ の strength は big き く reduce し て お り, こ の - different に よ っ て big き な structure - the が お こ っ て い る も の と think わ れ た. Line heat - sex be 験 を い thermal stability を adjustable べ て み る と, hot - の planning move temperature は wild-type に than べ, ほ ぼ 6 ℃ ほ ど low し て い た. The にGlu203をアラニ に に に is used to replace the させた variant を to make the <s:1>, and the と is the same as the <s:1>. The を line った is analyzed. <s:1> <s:1> variation によって, enzyme activity <s:1> complete になくな, R215A と similar <s:1> structural variation がみられた. Youdaoplaceholder0 thermal variation さらに 転 shift temperature さらに ほぼ6℃ lower <s:1> た. Above よ り, Arg215 は catalyst residue の nearly alongside に お い て, Glu203 と interaction line を う こ と に よ っ て, catalyst residue の ミ ク ロ を comfortable environment are な も の に bartender っ て い る も の と think わ れ た.

项目成果

Tamo Fukamizo: "Disruption of the gene encoding the ChiB1 chitinase of Aspergillus fumigatus and characterization of a recombinant gene product"Microbiology. 149. 2931-2939 (2003)

Tamo Fukamizo：“烟曲霉 ChiB1 几丁质酶编码基因的破坏和重组基因产物的表征”微生物学。

Molecular characterization of the essential response regulator protein YycF in Bacillus subtilis.

枯草芽孢杆菌中必需反应调节蛋白 YycF 的分子特征。

• 发表时间: 2003
• 期刊: J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 6
• 作者: Tamo Fukamizo;Tamo Fukamizo
• 通讯作者: Tamo Fukamizo

Tamo Fukamizo: "Family 19 chitinases from rice (Oryza sativa L.):substrate-binding subsites demonstrated by kinetic and molecular modeling studies"Plant Molecular Biology. 52. 43-52 (2003)

Tamo Fukamizo：“来自水稻 (Oryza sativa L.) 的 19 种几丁质酶：通过动力学和分子模型研究证明的底物结合亚位点”植物分子生物学。

Tamo Fukamizo: "Kinetic Studies on the Hydrolysis of N-Acetylated and N-deacetylated Derivatives of 4-Methylumbelliferyl Chitobioside by the Family 18 Chitinases"J.Biochem.. 133. 253-258 (2003)

Tamo Fukamizo：“18 种几丁质酶家族对 4-甲基伞形基壳二糖苷的 N-乙酰化和 N-脱乙酰化衍生物水解的动力学研究”J.Biochem.. 133. 253-258 (2003)

Tamo Fukamizo: "A novel type of family 19 chitinase from Aeromonas sp.No.10S-24;cloning, sequence, expression, and the enzymatic properties."Eur.J.Biochem.. 270. 2513-2520 (2003)

Tamo Fukamizo：“来自气单胞菌属 sp.No.10S-24 的新型 19 族几丁质酶；克隆、序列、表达和酶特性。”Eur.J.Biochem.. 270. 2513-2520 (2003)