皮膚の再生機構の解明:ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入による胎児創傷治癒機構モデルの開発

阐明皮肤再生机制：导入透明质酸合酶基因建立胎儿伤口愈合机制模型

• 批准号: 14657196
• 负责人: 水木 大介
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Hirosaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657196/
• 关键词: 胎児創傷治癒; 瘢痕; ヒアルロン酸; 再生; 組織工学; SAGE法; ヒアルロン酸合成酵素

1、培養ヒト皮膚線維芽細胞からmRNAを抽出し,発現しているヒアルロン酸合成酵素(HAS(HAS1,HAS2,HAS3))の各遺伝子full-length cDNAを調整した。これをBluescript vectorにサブクローニングして大量に調整し、その塩基配列をautosequencerで解読した。次に各cDNAをBluescript vectorから再度切り出し、Neomycin耐性遺伝子の挿入されたpCY4Bタンパク質発現ベクター(pCY4B-Neo)(大阪大学 宮崎純一教授より分与)に組み込み、HASの発現ベクターであるHAS(-1,-2,-3)-pCY4B-NEOを調整した。2、各発現ベクターを培養ヒト皮膚線維芽細胞のcell lineにDOTAP法によって導入した。数日ごとにNeomycinでselectionを行って、最終的にすべての細胞の染色体にHAS遺伝子がstableに組み込まれたものになるまで細胞培養を繰り返した。3、得られた各細胞の培地を回収し、培地中に分泌されるヒアルロン酸量をカルバゾール硫酸法およびセルロースアセテート膜電気泳動等により解析した。その結果、HAS-1,-2,-3遺伝子の挿入された細胞の培地中に非常に高レベルなヒアルロン酸分泌量の上昇を確認した。4、各HAS遺伝子がstableに導入された細胞および導入されていない細胞からそれぞれmRNAを抽出し、cDNAを調整した後、各細胞における遺伝子の発現動態をSerial analysis gene expression (SAGE)法によって解析した。すなわち、制限酵素消化,リンカーライゲーション及びPCR法によって,発現するすべての遺伝子の3'末端11bpを調製し、これらをライゲーションによって互いに結合させ,autosequencerを用いてその塩基配列を決定した。その結果、HAS遺伝子が導入された細胞で顕著に発現する,或いは抑制する遺伝子として29種類の遺伝子が確認された。現在、その遺伝子が皮膚再生のマスター遺伝子かどうか検討中である。5、また同時に、今回確認された29種類の遺伝子をさらにpCY4B-NEOベクターにサブクローニングしnaked DNA法を用いてヌードマウスの瘢痕部に導入する準備をすすめている。

1, cultivating ヒ ト skin line d bud cells か ら mRNA し を spare, 発 now し て い る ヒ ア ル ロ ン acid synthetase (from (HAS1 HAS2, HAS3)) の each legacy 伝 son full - length cDNA を adjustment し た. こ れ を Bluescript vector に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し て に adjust し, そ の salt base with column を autosequencer で solution 読 し た. に each cDNA を Bluescript vector か ら り cutting out し again, Neomycin patience but 伝 の scions into さ れ た pCY4B タ ン パ ク qualitative 発 now ベ ク タ ー (pCY4B - Neo) (Osaka university Miyazaki professor junichi よ り points with) に group み 込 み, from の 発 now ベ ク タ ー で あ る from (1, 2, 3) - pCY4B - NEO を adjustment し た. 2. Each occurrence ベ タ を を を culture ヒト skin line germ cells <s:1> cell lineにDOTAP method によって introduction to た. Days ご と に Neomycin で selection line を っ て, eventually に す べ て の の cells chromosome に HAS survived 伝 son が stable に group み 込 ま れ た も の に な る ま で cell culture を Qiao り return し た. 3, ら れ た each cell の petty を back 収 し secretion, the petty に さ れ る ヒ ア ル ロ ン acid amount を カ ル バ ゾ ー ル sulfuric acid method お よ び セ ル ロ ー ス ア セ テ ー ト membrane electric 気 swimming etc に よ り parsing し た. そ の results, from 1, 2, or 3 heritage 伝 son の scions into さ れ た cells の petty に very high に レ ベ ル な ヒ ア ル ロ ン acid secretion の rise を confirm し た. 4, all from the heritage 伝 son が stable に import さ れ た cells お よ び import さ れ て い な い cells か ら そ れ ぞ れ mRNA を spare し, cDNA を adjustment し た after, each cell に お け る heritage 伝 son の 発 now dynamic を Serial analysis of gene expression The (SAGE) method によって parses た. す な わ ち limitations, enzyme digestion and リ ン カ ー ラ イ ゲ ー シ ョ ン and び PCR method に よ っ て, 発 now す る す べ て の posthumous son 伝 の 3 'end 11 bp を し modulation, こ れ ら を ラ イ ゲ ー シ ョ ン に よ っ て mutual い に combining さ せ, autosequencer を with い て そ の salt base with column を decided し た. そ の results, from but 伝 が import さ れ た cells で 顕 the に 発 now す る, or い は inhibit す る heritage 伝 son と し て 29 kinds の heritage 伝 son が confirm さ れ た. Now, the そ cultural heritage 伝 is in the process of が skin regeneration <s:1> スタ 検 伝 cultural heritage 伝 う う う 検 である is being discussed である. 5, ま た に at the same time, today returned to confirm さ れ た 29 kinds の posthumous son 伝 を さ ら に pCY4B - NEO ベ ク タ ー に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し を naked DNA method with い て ヌ ー ド マ ウ ス の scar of に import す る prepare を す す め て い る.