内耳感覚細胞再生のための細胞レベルでの機能評価法の確立に関する分子生物学的研究

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本年度は研究計画に従いモルモットを用い、蝸牛、前庭器を摘出し、一部はそのまま器官培養、一部は単離有毛細胞としin vitroでの実験系を確立した。細胞の静止を迅速に判定するシステムとしては蛍光プローブ(LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, Molecular Probes)を応用した。その結果、蛍光プローブによる判定と細胞形態による判定はよく相関し、簡便、迅速に細胞の生死を判定することが可能となった。さらに、使用材料に関しては細胞の生死の判定には単離有毛細胞を用いるほうが良好な結果を得ることがわかった。また、細胞機能による評価のために細胞の一酸化窒素、活性酸素種の発生に注目しそれぞれの産生を一酸化窒素はDAF-2DA、活性酸素種はDHTM-Rosを使用して検討した結果、生体内での一酸化窒素、活性酸素種の産生を良好に検出することができた。これらの2種類の蛍光プローブを同時に使用することにより一酸化窒素と活性酸素種の同時検出が可能となり細胞機能の評価ができた。この目的のためには器官培養系を用いるのが良いことも明らかとなった。これらの結果を利用して細胞障害条件の検討を行った結果、アミノ配糖体のゲンタマイシンによる障害が内耳感覚細胞障害モデルとして一般的に応用可能であることが示され、各種抗酸化剤、NOS阻害剤、神経成長因子、HSP誘導剤などにより細胞障害が予防可能であることを明らかにした。これらのin vitroの結果はin vivoでの結果と良く相関し、今回開発したin vitroの実験系が内耳障害の研究に広く応用できることが示された。これらの成果は40th Workshop on Inner Ear Biology、第13回日本耳科学会、第62回日本めまい平衡医学会で発表されると共に6編の論文にまとめられた。