ヒト角膜内皮細胞における発現遺伝子の分子生物学的機能解析

人角膜内皮细胞表达基因的分子生物学功能分析

• 批准号: 14657451
• 负责人: 水流 忠彦
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657451/
• 关键词: cDNAライブラリー; DDB2; 紫外線; 角膜内皮細胞; DNA修復; スプライシングバリアント; DDB1; 角膜; 内皮細胞; cDNA; 遺伝子; 派生体

ヒト角膜内皮細胞からmRNAを抽出し、作成したヒト角膜内皮細胞cDNAライブラリーの中で、発現率の高いDDB2 (damaged DMA-binding protein 2)に着目した。培養ヒト角膜内皮細胞(HCEC)を用いて、紫外線照射後のNER関連遺伝子の発現をRNase protection assayにて検討したところ、紫外線障害時には速やかにNER関連遺伝子の発現増加が認められ、それらの中でDDB2は最も発現増加率が高かった。さらにDDB2発現アデノウイルスベクターを用いて培養ヒト角膜内皮細胞にDDB2を感染させ、紫外線照射後のDNA修復活性を検討したところ紫外線障害DNA修復が有意に促進された。以上より、ヒト角膜内皮において多く発現するDDB2は、紫外線照射時にはさらに発現を増加させ、紫外線障害DNA修復の一役を担っていると考えられた。次に角膜内皮細胞より得られた新規DDB2スプライシングバリアント(D1-D4)を同定し、紫外線障害DNA修復における機能とそのメカニズムについて分子生物学的検討を行った。スプライシングバリアントを同定し、D1-D4発現プラスミドを作成し、リポフェクション法にてHeLa細胞にD1-D4を一過発現させた条件下において、紫外線障害DNA修復を検討したところ、D1、D2において修復抑制効果が認められた。免疫沈降法を用いた検討では、DDB2-WTはDDB1と結合し、さらにWT同志で結合することが示された。一方D1、D2はDDB1とは結合しなかったが、D1においてはDDB2-WTとの結合が認められ、DDB2-WTとD1のDDB1への競合阻害がDNA障害修復抑制の原因である可能性が示唆された。

ヒ ト corneal endothelial cells か ら mRNA を spare し, consummate し た ヒ ト corneal endothelial cells cDNA ラ イ ブ ラ リ ー の で, 発 rate high の い DDB2 (on DMA - binding protein 2) に with mesh し た. When ヒト corneal endothelial cells (HCEC) were cultured and を were irradiated with て and ultraviolet light, the <s:1> NER was associated with the production of をRNase protection Beg し assay に て 検 た と こ ろ, uv handicap of に は speed や か に NER masato even heritage 伝 son の 発 now rights が recognize め ら れ, そ れ ら の in で DDB2 は most も 発 now raised rates high が か っ た. さ ら に DDB2 発 now ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク タ ー を with い て cultivate ヒ ト corneal endothelial cells に DDB2 を infection さ せ, の DNA repair after ultraviolet radiation, active を beg し 検 た と こ ろ ultraviolet handicap of DNA repair が intentionally に promote さ れ た. Above よ り, ヒ ト corneal endothelial に お い て more く 発 now す る DDB2 は, ultraviolet light に は さ ら に 発 now を raised さ せ, ultraviolet handicap of DNA repair the battle の を bear っ て い る と exam え ら れ た. Time に corneal endothelial cells よ り have ら れ た new rules DDB2 ス プ ラ イ シ ン グ バ リ ア ン ト (D1 - D4) を し, uv handicap of DNA repair に お け る function と そ の メ カ ニ ズ ム に つ い beg を line っ て 検 molecular biology た. ス プ ラ イ シ ン グ バ リ ア ン ト を with し, D1 - D4 発 now プ ラ ス ミ ド を し, consummate リ ポ フ ェ ク シ ョ ン method に て HeLa に D1 - D4 after を 発 now さ せ た conditions に お い て, ultraviolet handicap of DNA repair を beg し 検 た と こ ろ, D1, D2 に お い て repair inhibition of unseen fruit が recognize め ら れ た. Immune を sink method with い た beg で 検 は, DDB2 - WT は DDB1 と し, さ ら に WT comrade で combining す る こ と が shown さ れ た. Party D1, D2, は DDB1 と は combining し な か っ た が, D1 に お い て は DDB2 - WT と の combining が recognize め ら れ, DDB2 - WT と D1 の DDB1 へ の competition resistance against が handicap of DNA repair reasons の で あ が る possibility in stopping さ れ た.

项目成果

Sakai R, Kinouci T, et al.: "Construction of human corneal endothelial cDNA library and identification of novel active genes"Invest Ophthalmol Vis Sci. 43・6. 1749-1756 (2002)

Sakai R、Kinouci T 等：“人角膜内皮 cDNA 文库的构建和新型活性基因的鉴定”Invest Ophasemol Vis Sci 43・6（2002）。

Inoki T, et al.: "Human DDB2 splicing variants are dominant negative inhibitors of UV-damaged DNA repair."Biochem Biophys res Commun.. 314・4. 1036-1043 (2004)

Inoki T 等人：“人类 DDB2 剪接变体是紫外线损伤 DNA 修复的显性负性抑制剂。”Biochem Biophys res Commun.. 1036-1043 (2004)。