ヒト角膜内皮細胞における発現遺伝子の分子生物学的機能解析

ヒト角膜内皮細胞からmRNAを抽出し、作成したヒト角膜内皮細胞cDNAライブラリーの中で、発現率の高いDDB2 (damaged DMA-binding protein 2)に着目した。培養ヒト角膜内皮細胞(HCEC)を用いて、紫外線照射後のNER関連遺伝子の発現をRNase protection assayにて検討したところ、紫外線障害時には速やかにNER関連遺伝子の発現増加が認められ、それらの中でDDB2は最も発現増加率が高かった。さらにDDB2発現アデノウイルスベクターを用いて培養ヒト角膜内皮細胞にDDB2を感染させ、紫外線照射後のDNA修復活性を検討したところ紫外線障害DNA修復が有意に促進された。以上より、ヒト角膜内皮において多く発現するDDB2は、紫外線照射時にはさらに発現を増加させ、紫外線障害DNA修復の一役を担っていると考えられた。次に角膜内皮細胞より得られた新規DDB2スプライシングバリアント(D1-D4)を同定し、紫外線障害DNA修復における機能とそのメカニズムについて分子生物学的検討を行った。スプライシングバリアントを同定し、D1-D4発現プラスミドを作成し、リポフェクション法にてHeLa細胞にD1-D4を一過発現させた条件下において、紫外線障害DNA修復を検討したところ、D1、D2において修復抑制効果が認められた。免疫沈降法を用いた検討では、DDB2-WTはDDB1と結合し、さらにWT同志で結合することが示された。一方D1、D2はDDB1とは結合しなかったが、D1においてはDDB2-WTとの結合が認められ、DDB2-WTとD1のDDB1への競合阻害がDNA障害修復抑制の原因である可能性が示唆された。

ヒト角膜内皮細胞からmRNAを抽出し、作成したヒト角膜内皮細胞cDNAライブラリーの中で、発現率の高いDDB2 (damaged DMA-binding protein 2)に着目した。培養ヒト角膜内皮細胞(HCEC)を用いて、紫外線照射後のNER関連遺伝子の発現をRNase protection assayにて検討したところ、紫外線障害時には速やかにNER関連遺伝子の発現増加が認められ、それらの中でDDB2は最も発現増加率が高かった。さらにDDB2発現アデノウイルスベクターを用いて培養ヒト角膜内皮細胞にDDB2を感染させ、紫外線照射後のDNA修復活性を検討したところ紫外線障害DNA修復が有意に促進された。以上より、ヒト角膜内皮において多く発現するDDB2は、紫外線照射時にはさらに発現を増加させ、紫外線障害DNA修復の一役を担っていると考えられた。次に角膜内皮細胞より得られた新規DDB2スプライシングバリアント(D1-D4)を同定し、紫外線障害DNA修復における機能とそのメカニズムについて分子生物学的検討を行った。スプライシングバリアントを同定し、D1-D4発現プラスミドを作成し、リポフェクション法にてHeLa細胞にD1-D4を一過発現させた条件下において、紫外線障害DNA修復を検討したところ、D1、D2において修復抑制効果が認められた。免疫沈降法を用いた検討では、DDB2-WTはDDB1と結合し、さらにWT同志で結合することが示された。一方D1、D2はDDB1とは結合しなかったが、D1においてはDDB2-WTとの結合が認められ、DDB2-WTとD1のDDB1への競合阻害がDNA障害修復抑制の原因である可能性が示唆された。