歯根膜およびセメント質に特異的に発現する遺伝子のクローニング

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レーザーキャプチャー顕微鏡を用いたマイクロダイセクションシステムは、顕微鏡観察下において組織切片から単一の標的細胞集団のみを正確に採取して、その標的細胞からRNAの抽出を可能にした画期的なシステムである。そして、その正確に分離・採取された各細胞集団から得られたRNAを比較解析すれば、それぞれに特異的なマーカーを同定することも可能だと考えられる。当初予定していた、パラフィン切片から抽出したRNAは損傷が大きく、今回用いるマイクロアレイによる遺伝子配列の解析には適さないことがわかってきたため、RNAを凍結切片から抽出する方法に変更したが、周知のように硬組織の非脱灰凍結切片の作製が想像以上に困難であった。この問題をクリアするために試行錯誤した結果、特殊なブレードとフィルムおよびUV照射を使った方法により、LCMに応用できる非脱灰凍結切片の作製が可能となった。これまでに、これらの非脱灰凍結切片からは、18Sおよび28Sのピークが明瞭な良質のRNAが採取できることがバイオアナライザーを用いた解析により明らかとなった。現在microarrayの過程にあるが、採取した細胞から抽出したRNAを、増幅しPCR解析を行った結果、GAPDH、オステオカルシン、1型コラーゲン、ボーンシアロプロテイン、BMP-2などの発現を示す明瞭なバンドが確認され、この方法の信頼性が確認された。