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Introduction of foreigh gene into fertilizes mammalian egg by microinjection

显微注射引入外源基因使哺乳动物卵子受精

基本信息

批准号：
61480075
负责人：
SHODA Yoichi
金额：
$ 4.48万
依托单位：
Ibaraki University (1987-1988)The University of Tokyo (1986)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至 1987
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に引き続き微量注入法による外来性遺伝子の導入を試みた. 本年度では条件の検討, 外来性遺伝子の組み込みの有無を詳しく調べた. 用いた遺伝子はPBR322をベクターとして5′上流にヒト成長ホルモンの構造遺伝子を持っている. プラスミドDNAをBstEII-EcoR1で消化し得らる2.5KbのDNAである. 遺伝子解析には, 成長ホルモンの構造遺伝子を含む1.1KbのPvuII断片を用いた. 動物は, 4週令のC57BL/6N雌マウスでPMSG-hCGで過排卵処理した後, 成熟雄マウスと交配し卵管膨大部より受精卵で得た. この受精卵に上記DNAを1〜2pl微量注入した. 炭酸ガス培養器で培養し, 二細胞期の胚を偽妊娠マウスに移植した. 遺伝子の検索は, 胎児又は出生産子をプロナーゼKで消化しフェノール抽出で得られたDNAについてドットプロット・サザンブロットで行なった. (1)EDTAの影響. 低濃度では72〜89%に卵割が観察され, 無処理群より少し低かった. 胚盤胞にまで発生する割合は, EDTA濃度の増加に伴なって低下し, 5nMでは3.7%と極端に低かった. (2)DNAの影響. DNA濃度の増加に伴なって卵割率は低下した. 着床率は, 100〜1000コピー/plで無操作の卵とほど同等であったが, 10000コピー/plの濃度では着床率・着床以後の生存率共に他の群に比較し極端に低かった(5%以下). (3)外来遺伝子組み込み体の出生. 雄性前核に100コピー/plのDNA溶液を微量注入し, 卵割した109個の卵を仮親の卵管内に移植し, 内19匹の産子が得られた. この19匹中12匹は離乳にまで至ったが, 7匹は出生直後の種々の原因により死亡したため調べることが出来なかった. ドットブロット・サーザンブロットにより注入したDNAの体細胞へ組み込まれた量及びその大さを調べたところ, その内の1匹に150〜200コピー/細胞でほぼ同じ大きさのDNAが組み込まれていた.

In the previous year, the microinjection method was introduced to test the introduction of exotic drugs. In the current year, the condition is poor, and the exotic child group is not responsible for this year. Use the high-end PBR322 to grow up and make the baby to hold the phone. After DNA BstEII-EcoR1 digestion, you get 2.5Kb DNA digestion. In the analysis of the 1.1Kb, the growth of the PvuII fragments is made by the growth of the chips. After 4 weeks of C57BL/6N, the female female was forced to PMSG-hCG after ovulation, and then the mature male mating, the enlarged part of the oviduct and the fertilized egg. DNA 1~2pl was microinjected into the fertilized egg. Carbonic acid incubator, second-stage embryo, pregnancy, transplant. The baby was born, the baby was born, the baby was digested, the baby was digested, the baby was pulled out, the baby was DNA, and the baby was born. (1) EDTA shadow. The low temperature is 7289%. The egg is cut and checked, and there is no reason why the group is low. The embryo cells are cut off, the EDTA is low, the 5nM is 3.7%, and the end is low. (2) DNA shadow. The rate of egg cutting is low in DNA patients. The implantation rate was 100