興奮性アミノ酸レセプターの単離精製に関する研究

ラット脳のN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)レセプター複合体の可溶化および精製を[^3H]グルタミン酸(Glu)結合を指標として試みた。脳膜標品を1%デオキシコール酸(DOC)で可溶化した。本実験条件下の可溶化標品中には、NMDAアゴニスト、グリシン(Gly)およびポリアミンに感受性を持つ[^3H](+)-5-methyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5,10-imine(MK-801)結合部位が存在した。さらに、本標品中のNMDA感受性[^3H]Glu結合および[^3H]Gly結合を測定したところ、ともに蛋白質量依存性の特異的結合が検出された。[^3H]Glu結合に対するアゴニストの効果を検討したところ、NMDA、DL-α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid(AMPA)およびカイニン酸(KA)はいずれも濃度依存的に結合を阻害したが、10^<-4>MのNMDA、AMPAあるいはKAの添加時でもそれぞれ40.8±3.7%、58.2±3.7、51.9±4.8の結合が残存していた。NMDA(10^<-4>M)存在下の結合は、Glu、AMPAおよびKAにより完全に阻害されたが、NMDAアンタゴニストの(±)-3-(2-carboxypiperazin-4-yl)propyl-1-phosphonate(CPP)およびD-2-amino-5-phosphonovalerate(D-AP5)では阻害されなかった。一方、AMPA(10^<-4>M)あるいはKA(10^<-4>M)存在下の結合は、いずれもGlu、NMDA、CPPおよびD-AP5より阻害されたまた、AMPAあるいはKA存在下の結合はそれぞれKAおよびAMPAでは著変を受けなかった。次に、DEAE-Toyopearl 650Mカラムクロマトグラフィを行ったところ、0.05、0.1、0.2、0.3および0.5M KClのすべての溶出画分に[^3H]Glu結合が検出され、それぞれ画分I、II、III、IVおよびVとした。画分1の結合はNMDA、AMPAあるいはKAのいずれの添加でも阻害されず、QAでのみ阻害された。一方、画分II〜Vの結合はすべてのアゴニストにより阻害された。その中で画分IIはNMDAによる阻害が比較的微弱であるのに対して、画分III〜VではNMDAによる阻害成分の割合が比較的高いことが判明した。

ラット脳のN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)レセプター複合体の可溶化および精製を[^3H]グルタミン酸(Glu)結合を指標として試みた。脳膜標品を1%デオキシコール酸(DOC)で可溶化した。本実験条件下の可溶化標品中には、NMDAアゴニスト、グリシン(Gly)およびポリアミンに感受性を持つ[^3H](+)-5-methyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5,10-imine(MK-801)結合部位が存在した。さらに、本標品中のNMDA感受性[^3H]Glu結合および[^3H]Gly結合を測定したところ、ともに蛋白質量依存性の特異的結合が検出された。[^3H]Glu結合に対するアゴニストの効果を検討したところ、NMDA、DL-α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid(AMPA)およびカイニン酸(KA)はいずれも濃度依存的に結合を阻害したが、10^<-4>MのNMDA、AMPAあるいはKAの添加時でもそれぞれ40.8±3.7%、58.2±3.7、51.9±4.8の結合が残存していた。NMDA(10^<-4>M)存在下の結合は、Glu、AMPAおよびKAにより完全に阻害されたが、NMDAアンタゴニストの(±)-3-(2-carboxypiperazin-4-yl)propyl-1-phosphonate(CPP)およびD-2-amino-5-phosphonovalerate(D-AP5)では阻害されなかった。一方、AMPA(10^<-4>M)あるいはKA(10^<-4>M)存在下の結合は、いずれもGlu、NMDA、CPPおよびD-AP5より阻害されたまた、AMPAあるいはKA存在下の結合はそれぞれKAおよびAMPAでは著変を受けなかった。次に、DEAE-Toyopearl 650Mカラムクロマトグラフィを行ったところ、0.05、0.1、0.2、0.3および0.5M KClのすべての溶出画分に[^3H]Glu結合が検出され、それぞれ画分I、II、III、IVおよびVとした。画分1の結合はNMDA、AMPAあるいはKAのいずれの添加でも阻害されず、QAでのみ阻害された。一方、画分II〜Vの結合はすべてのアゴニストにより阻害された。その中で画分IIはNMDAによる阻害が比較的微弱であるのに対して、画分III〜VではNMDAによる阻害成分の割合が比較的高いことが判明した。