種々の変異体を用いたSCFの構造と機能の解析

使用各种突变体分析 SCF 结构和功能

• 批准号: 04671512
• 负责人: 東條 有伸
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04671512/

Stem cell factor(SCF)はストローマ細胞が産生し、未分化造血幹細胞の増殖分化を支える造血因子である。SCFは本来膜結合蛋白質として合成されるが、一部は細胞膜挿入後に酵素の作用で切断され、細胞外へ分泌される。この分泌型SCFも生物活性を有することが知られている。本年度の研究計画に基づいて、われわれはマウスSCFcDNAを3'末端から順次欠失させた一連の変異体を作製し、これらを用いてSCFの構造と機能の関係を解析した。既にクローン化済みの完全長SCFcDNAを制限酵素で切断後、マングビーンヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼIIIの処理によって細胞外領域のみをコードする長さまで欠失させた。得られたSCFcDNA変異体6種類の塩基配列を決定した結果、それらはシグナルペプチドを除きN末端からそれぞれ183、179、162、149、142および133アミノ酸をコードしていた。また、C末端にはリンカー由来の数アミノ酸が付加されていた。次に、発現ベクターに組み込んだ各々のcDNAをDEAEデキストラン法でCOS細胞にトランスフェクションし、72時間後に培養上清を回収してその生物活性を以下の2つの方法で検討した。(1)MTT法を用いてヒト造血因子依存性細胞株TF-1の増殖支持活性を調べた。(2)5-FU処理マウスの骨髄細胞を標的として、IL3、EPO共存下でのhigh proliferative potentialーcolony forming cell(HPPーCFC)刺激活性を調べた。また、^<35>S-メチオニンで各cDNA導入COS細胞の培養上清を標識後SDSーPAGEを行い、アミノ酸数から予測される大きさのSCF蛋白質が合成されているかどうか確認した。結果として、まず各SCFcDNA変異体は予測されるサイズのSCF蛋白質をコードすることが確認された。さらにマウスSCFのN末端142アミノ酸残基は上述した両方の生物活性を有するが、133アミノ酸残基では失活することが判明した。従って、Asp^<134>からSer^<142>までの間にマウスSCFの活性保持に重要な配列が存在すると考えられた。

Stem cell factor(SCF) is a hematopoietic factor that causes differentiation and proliferation of undifferentiated hematopoietic stem cells. SCF is composed of membrane-bound proteins, some of which are cut off by enzymes after cell membrane penetration, and some of which are secreted outside the cell. The secretory SCF has biological activity. This year's research plan is to analyze the relationship between SCF structure and function. The complete length of SCFcDNA in the extracellular domain was cut off, and the length of SCFcDNA in the extracellular domain was reduced. The results showed that the cDNA sequence of SCF6 was different, and the nucleotide sequence of SCF6 was different from that of SCF7. The nucleotide sequence of SCF7 was different from that of SCF7. The nucleotide sequence of SCF7 was different from that of SCF7. The nucleotide sequence of SCF7 was different from that of SCF7. The nucleotide sequence of SCF7 was different from that of SCF7. C-terminal and C-terminal amino acids were added to the mixture. In the second step, the cDNA of each component was detected by DEAE assay. The COS cell culture supernatant was recovered after 72 hours. The biological activity of each component was detected by the following two methods. (1)MTT assay was used to regulate the growth support activity of TF-1 cell line. (2)5-FU treatment modulated the stimulation activity of high proliferative potential colony forming cell(HPP CFC) under the condition of IL-3 and EPO blue-shift. The <35>culture supernatant of COS cells into which each cDNA was introduced was identified by SDS PAGE, and the SCF protein synthesis was confirmed by PCR. The results showed that the SCF cDNA variants were predicted and identified. The N-terminal 142-amino acid residue of SCF was found to have the biological activity of the above mentioned formula. In <134>the meantime, it is important to maintain <142>the activity of SCF.

项目成果

Mitsuo Nishikawa: "Changes in hematopoiesisーsupporting ability of C3H10T1/2murine embryo fibroblasts during differentiation." Blood. 81. (1993)

Mitsuo Nishikawa：“C3H10T1/2小鼠胚胎成纤维细胞分化过程中造血支持能力的变化。”（1993）

Mitsuo Nishikawa: "Deletion mutagenesis of stem cell factor defines the Cーterminal sequences essential for its biological activity." Biochemical and Biophysical Research Communications. 188. 292-297 (1992)

Mitsuo Nishikawa：“干细胞因子的缺失诱变定义了其生物活性所必需的 C 末端序列。” 188. 292-297 (1992)