マスト細胞の高親和性IgEレセプターに会合する細胞内シグナル伝達系の研究

当初の研究計画に基づき、ラットRBL-2H3細胞におけるCD45の発現の解析を行った。ラットCD45の8種類のアイソタイプに共通した部位を認識することが知られている抗ラットCD45モノクローナル抗体OX-1を用いて解析したところ、FACS解析においてRBL-2H3細胞はOX-1との反応性を示したが、発現量は非常に少ないことが判明した。RBL-2H3細胞に発現しているCD45をOX-1を用いて免疫沈降したところ、分子量180kDのバンドが認められ、発現しているCD45アイソタイプは最短のもの(CD45RO)であることが示唆された。このことはRT-PCR法を用いたmRNAの発現の解析においても確認された。FcεRIとCD45の会合の解析のためにはCD45をイムノブロット法で検出することが不可欠であるが、OX-1はこの解析には使えないことが判明した。他の市販されている抗体はすべてCD45RO以外のアイソタイプに特異的なものなのでRBL-2H3には用いることができない。そこで、ラットCD45に対するポリクローナル抗体を調製することにした。RT-PCR法でCD45の細胞外部分をクローニングし、これをQIAexpress pQE発現ベクターに組み込んでヒスチジンタグを結合した融合タンパク質として大腸菌に大量生産させて精製し、ウサギに免疫する予定である。現在までにCD45のクローニングは完了し、発現ベクターに組み込んで生産の確認を行っている段階であるが、抗血清ができしだいCD45とFeεRIとの会合やFcεRIの凝集に伴なうCD45のホスファターゼ活性の変動などについて解析する予定である。

当初の研究計画に基づき、ラットRBL-2H3細胞におけるCD45の発現の解析を行った。ラットCD45の8種類のアイソタイプに共通した部位を認識することが知られている抗ラットCD45モノクローナル抗体OX-1を用いて解析したところ、FACS解析においてRBL-2H3細胞はOX-1との反応性を示したが、発現量は非常に少ないことが判明した。RBL-2H3細胞に発現しているCD45をOX-1を用いて免疫沈降したところ、分子量180kDのバンドが認められ、発現しているCD45アイソタイプは最短のもの(CD45RO)であることが示唆された。このことはRT-PCR法を用いたmRNAの発現の解析においても確認された。FcεRIとCD45の会合の解析のためにはCD45をイムノブロット法で検出することが不可欠であるが、OX-1はこの解析には使えないことが判明した。他の市販されている抗体はすべてCD45RO以外のアイソタイプに特異的なものなのでRBL-2H3には用いることができない。そこで、ラットCD45に対するポリクローナル抗体を調製することにした。RT-PCR法でCD45の細胞外部分をクローニングし、これをQIAexpress pQE発現ベクターに組み込んでヒスチジンタグを結合した融合タンパク質として大腸菌に大量生産させて精製し、ウサギに免疫する予定である。現在までにCD45のクローニングは完了し、発現ベクターに組み込んで生産の確認を行っている段階であるが、抗血清ができしだいCD45とFeεRIとの会合やFcεRIの凝集に伴なうCD45のホスファターゼ活性の変動などについて解析する予定である。