ステロイドスルホトランスフェラーゼの部位特異的変異誘発

类固醇磺基转移酶的定点诱变

• 批准号: 07672378
• 负责人: 本間 浩
• 金额: --
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07672378/
• 关键词: スルホトランスフェラーゼ; 部位特異的変異誘発; 活性硫酸; PAPS; ラット; 肝臓

ラット肝臓ヒドロキシステロイドスルホトランスフェラーゼ(ST)のcDNAを大腸菌内で発現させた組替え体STは、dehydroepiandrosterone(DHEA)とcortisol(CS)に対してST活性を示す。今回我々は、このcDNAを用いて、部位特異的変異誘発の手法により種々の変異体を作製した。過去の研究成果に基づき、histidine残基の変異株を調整し活性に与える影響を調べた。その結果、98番目のhistidine残基をalanineやlysineに変換したもの(H-98変異体)では、DHEAやCSに対するST活性が完全に失われることが明らかになった。また、ST活性の補酵素である活性硫酸(PAPS)に対する親和性を、PAP-agaroseアフィニティーゲルを用いて検討した。その結果、野生株はこのアフィニティーゲルに吸着し100μMのPAPで特異的に脱着され溶出されるのに対して、H-98変異体ではまったく吸着されなかった。したがって、98番目のhistidine残基は、PAPS総合部位に関与するかまたはその構造を保持するために重要な残基であると考えられる。一方、255番目のasparagine残基をalanineに変異したものは、CSに対するST活性のみが約1/5に減少していた。速度論理的解析から、この変異株ではCSに対するKm値のみが野生株に対して有意に増加しており、PAPSやDHEAに対するKm値は変化していないことが明らかになった。したがって、野生株のSTではDHEAとCSに対して異なる結合部位を持っており、255番目のasparagineはCS結合部位に特異的に関与しているものと考えられる。

Crucial ラ ッ ト liver ヒ ド ロ キ シ ス テ ロ イ ド ス ル ホ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (ST) の cDNA を coliform in で 発 now さ せ た group for ST は え body, dehydroepiandrosterone (DHEA) と cortisol (CS) に し seaborne て ST active を す. This time, I 々 々 and <s:1> to induce cDNAを using 々 て and site-specific mutation-inducing techniques によ and to breed 々 mutant を to create た. Past <s:1> research results show that に base づ に and histidine residue <s:1> variants を adjust the <s:1> activity に and える effects on を modulating べた. そ の results, 98's mesh の histidine residues を alanine や lysine に variations in し た も の (1-98 - H) で は, DHEA や CS に す seaborne る ST active が entirely に lost わ れ る こ と が Ming ら か に な っ た. ま た, ST activity の repair enzyme で あ る activity (PAPS) sulfate に す seaborne る affinity を, PAP - agarose ア フ ィ ニ テ ィ ー ゲ ル を with い て beg し 検 た. そ の results, wild strains は こ の ア フ ィ ニ テ ィ ー ゲ ル に sorption し 100 microns の PAP で specific に off the さ れ dissolution さ れ る の に し seaborne て, H - 98 - variant で は ま っ た く sorption さ れ な か っ た. し た が っ て, 98's mesh の histidine residues は, PAPS 総 close parts に masato and す る か ま た は そ の tectonic を keep す る た め に important な residues で あ る と exam え ら れ る. Side, 255's mesh の asparagine residues を alanine に - different し た も の は, CS に す seaborne る ST active の み が about 1/5 に reduce し て い た. Speed logical analytical か ら, こ の - different strains で は CS に す seaborne る Km numerical の み が wild strains に し seaborne て intentionally に raised plus し て お り, PAPS や DHEA に す seaborne る Km numerical は variations change し て い な い こ と が Ming ら か に な っ た. し た が っ て, wild strains の ST で は DHEA と CS に し seaborne て different な る combining site を hold っ て お り, 255's mesh の asparagine は CS combining site に specific に masato and し て い る も の と exam え ら れ る.

项目成果

Miyawaki,A.et al.: "Zonal distribution of sulfotransferase for phenol in olfactory sustentacular cells" EMBOJ.in the press. (1996)

Miyawaki,A.等人：“嗅觉支持细胞中苯酚磺基转移酶的区域分布”EMBOJ.在新闻中。