敗血症の治療を目的とする肝臓由来のLPS活性化因子の作用機序の解析と単離精製

1.肝LPS不活性化因子の単離精製:この因子は可溶性の分子量約35kDのタンパクであること以外には性状がほとんど明らかになっていなかった。そこで、精製の戦略的手段を探るため、マウスの肝臓より得られた粗画分のpHおよび温度安定性、さらに、LPSのTNF分泌誘導活性の阻害に基づくLPS不活性化作用に及ぼすイオン強度、pHの効果を検討した。その結果、pHが8以上、4℃以下で安定であることが判り、pH8.5以上でのAnionicイオン交換クロマトグラフィーで効率よく精製できること、および、ゲル濾過クロマトグラフィーの組み合わせが有効であることが判明した。また、より特異的な精製手段として、lipid Aを固定化したカラムを作製し、これの有効性を検討しつつある。2.LPS不活性化の作用序の解析:肝LPS不活性化因子とLPSとの直接的な相互作用を解析するために、マウス肝臓の粗画分と^<14>C標識lipid Aとの特異的な結合を固相系で明らかにし、また、この因子がLipid A加水分解活性を有しないことを反応後のTLC分析により確認した。さらに、結合および不活性化のキネティクスから、温度および時間依存的なlipid Aと本因子との結合・会合がその作用に重要であることが示された。3.肝LPS不活性化因子による敗血症の治療をめざした検討:肝LPS不活性化因子の臨床応用のための基礎として、LPSおよびlipid Aデリバティブに対する当因子の粗画分のin vitroでの効果(TNF誘導の阻害、limulus lysate活性化の阻害)を検討し、いずれに対しても活性を有することが明らかになった。

1.肝LPS不活性化因子の単離精製:この因子は可溶性の分子量約35kDのタンパクであること以外には性状がほとんど明らかになっていなかった。そこで、精製の戦略的手段を探るため、マウスの肝臓より得られた粗画分のpHおよび温度安定性、さらに、LPSのTNF分泌誘導活性の阻害に基づくLPS不活性化作用に及ぼすイオン強度、pHの効果を検討した。その結果、pHが8以上、4℃以下で安定であることが判り、pH8.5以上でのAnionicイオン交換クロマトグラフィーで効率よく精製できること、および、ゲル濾過クロマトグラフィーの組み合わせが有効であることが判明した。また、より特異的な精製手段として、lipid Aを固定化したカラムを作製し、これの有効性を検討しつつある。2.LPS不活性化の作用序の解析:肝LPS不活性化因子とLPSとの直接的な相互作用を解析するために、マウス肝臓の粗画分と^<14>C標識lipid Aとの特異的な結合を固相系で明らかにし、また、この因子がLipid A加水分解活性を有しないことを反応後のTLC分析により確認した。さらに、結合および不活性化のキネティクスから、温度および時間依存的なlipid Aと本因子との結合・会合がその作用に重要であることが示された。3.肝LPS不活性化因子による敗血症の治療をめざした検討:肝LPS不活性化因子の臨床応用のための基礎として、LPSおよびlipid Aデリバティブに対する当因子の粗画分のin vitroでの効果(TNF誘導の阻害、limulus lysate活性化の阻害)を検討し、いずれに対しても活性を有することが明らかになった。