膵島β細胞の高濃度ブドウ糖に対する不応性の機序の解析

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膵β細胞におけるブドウ糖不応性の機序の解明を目標に、以下の実験を行った。1 各種β細胞株のブドウ糖応答性の解析インスリン産生株であるβTC、NIT1、MIN6の各種分泌刺激物質に対する応答性を検討したところ、cAMP、PKCを介する系は正常(非株化)β細胞と比し増加率は低下していたが質的には比較的良好に維持されていた。しかし、ブドウ糖に対しては、MIN6においてのみ0.3mMから27.5mMのブドウ糖濃度の上昇に応じてインスリンの分泌が増加した。他の2株は反応性を失っており、ノーザンブロットにおいてもインスリンmRNAの増加は見られなかった。インスリン遺伝子発現の転写調節の解析転写制御の解析に当たって、ヒトインスリン遺伝子プロモーターエンハンサー領域のブドウ糖依存性転写活性を検討するためにレポーターとしてgreen fluorescent protein(GFP)を用いた検出系の作成を試みた。インスリン遺伝子上流の-363〜-346,+10〜+19に対するプライマーを設定し、ヒトDNAをもとに-363〜+19の部分をPCRにて増幅した。得られた産物の塩基配列を決定しこれをpGFP-1 promoter reporter vectorに結合し、リポフェクチン法でMIN-6及びβTCに導入した。また上記プロモーター部分の塩基配列中の、ブドウ糖応答性に関与する配列を決定するためにBgl II、 Pvu II、Mse Iの各制限酵素で切断して特定の部位の塩基配列のみを結合したベクターを作成し、同様に各々の株に導入した。48時間後、発現したGFPの蛍光活性を観察した。コントロールとしてCMVプロモーターに連結したGFPを発現させた細胞は470nmの励起光によって510‐520nmに蛍光のピークが観察された。インスリンプロモーターおよびその一部を連結したGFP発現ベクターについては、現在同様の実験系を用いて解析を進めているところである。