RNAiスクリーニング法を用いた肝細胞癌における新規癌関連遺伝子の同定

利用RNAi筛选方法鉴定肝细胞癌中新的癌症相关基因

• 批准号: 15H06332
• 负责人: 高井 淳
• 金额: $ 1万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-08-28 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H06332/
• 关键词: 肝細胞癌

本研究では、global RNAiスクリーニング法を用いて、EpCAM陽性肝癌細胞の維持に重要な役割を果たす遺伝子を網羅的に検索し、候補遺伝子群を同定した。EpCAM陽性細胞と陰性細胞が混在する肝癌細胞株であるHuH1細胞及びHuH7細胞をMagnetic-activated cell sorting systemを用いてEpCAM陽性群・陰性群に分離し、47,000種類の遺伝子を標的とした200,000種類のレンチウイルスshRNAベクターライブラリーを各々の群に感染多重度=1で感染導入した。3日間または5日間培養した後、全RNAを抽出し、各種shRNAに組み込まれた19塩基より成る固有の配列をPCRによって増幅させ、PCR産物を各種shRNA特異的なプローブとハイブリダイズさせ、マイクロアレイによって網羅的な定量解析を行った。得られたデータについて、同じ細胞(HuH1またはHuH7)由来の同じ期間だけ培養した(3日間または5日間)EpCAM陽性群と陰性群のshRNAプロファイルについてclass comparison analysisを行い、抽出されたshRNA群のうち、複数のshRNAの標的となっている遺伝子のみに絞り込み、さらにHuH1及びHuH7における3日間培養群及び5日間培養群で全ての比較解析で重複する遺伝子をEpCAM陽性群及び陰性群の維持にかかわる候補として選出した。その結果、EpCAM陽性細胞の維持にかかわる26種類の候補遺伝子、陰性細胞の維持にかかわる50種類の候補遺伝子を選出した。上記の76種類の遺伝子を用いて、247例の肝癌組織由来のマイクロアレイデータに対して階層型クラスタリング解析を行うと、症例群は2つのcluster分類された。このグループ分類は、免疫染色を用いたEpCAM陽性・陰性の分類結果とほぼ一致しており、選出された遺伝子群とEpCAM発現との関連性を強く示唆するものと考えられた。

In this study, the application of global RNAi in the maintenance of EpCAM-positive HCC cells was studied. EpCAM positive and negative cells were mixed in hepatocellular carcinoma cell lines, HuH1 cells and HuH7 cells. The Magnetic-activated cell sorting system was used to isolate EpCAM positive and negative groups. 47,000 species of shRNA were isolated and targeted. 200,000 species of shRNA were infected. 3. After 5 days of culture, the whole RNA was extracted, the PCR products were amplified, and the PCR products were analyzed quantitatively. Get a picture of the same cell. HuH1 HuH7 (3 days to 5 days)EpCAM positive group and negative group shRNA group selection, class comparison analysis, extraction of shRNA group selection, multiple shRNA target selection, Comparative analysis of the entire population of HuH1 and HuH7 day cultures and 5 day cultures was repeated to select candidates for EpCAM positive and negative populations. The results showed that 26 kinds of candidate genes for EpCAM positive cells and 50 kinds of candidate genes for EpCAM negative cells were selected. 76 kinds of genes were used, 247 cases of liver cancer tissue origin were analyzed, and 2 cases were classified into clusters. The results of EpCAM positive and negative classification were consistent with those of EpCAM positive and negative classification.

项目成果

Identification of novel cancer driver genes in hepatocellular carcinoma cells by RNAi screening method

RNAi筛选法鉴定肝细胞癌细胞中新的癌症驱动基因

• 发表时间: 2015
• 作者: Atsushi Takai