RNAiスクリーニング法を用いた肝細胞癌における新規癌関連遺伝子の同定

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本研究では、global RNAiスクリーニング法を用いて、EpCAM陽性肝癌細胞の維持に重要な役割を果たす遺伝子を網羅的に検索し、候補遺伝子群を同定した。EpCAM陽性細胞と陰性細胞が混在する肝癌細胞株であるHuH1細胞及びHuH7細胞をMagnetic-activated cell sorting systemを用いてEpCAM陽性群・陰性群に分離し、47,000種類の遺伝子を標的とした200,000種類のレンチウイルスshRNAベクターライブラリーを各々の群に感染多重度=1で感染導入した。3日間または5日間培養した後、全RNAを抽出し、各種shRNAに組み込まれた19塩基より成る固有の配列をPCRによって増幅させ、PCR産物を各種shRNA特異的なプローブとハイブリダイズさせ、マイクロアレイによって網羅的な定量解析を行った。得られたデータについて、同じ細胞(HuH1またはHuH7)由来の同じ期間だけ培養した(3日間または5日間)EpCAM陽性群と陰性群のshRNAプロファイルについてclass comparison analysisを行い、抽出されたshRNA群のうち、複数のshRNAの標的となっている遺伝子のみに絞り込み、さらにHuH1及びHuH7における3日間培養群及び5日間培養群で全ての比較解析で重複する遺伝子をEpCAM陽性群及び陰性群の維持にかかわる候補として選出した。その結果、EpCAM陽性細胞の維持にかかわる26種類の候補遺伝子、陰性細胞の維持にかかわる50種類の候補遺伝子を選出した。上記の76種類の遺伝子を用いて、247例の肝癌組織由来のマイクロアレイデータに対して階層型クラスタリング解析を行うと、症例群は2つのcluster分類された。このグループ分類は、免疫染色を用いたEpCAM陽性・陰性の分類結果とほぼ一致しており、選出された遺伝子群とEpCAM発現との関連性を強く示唆するものと考えられた。