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無血清培養系での口腔癌患者由来活性化リンパ球からのiPS細胞の樹立とその治療応用

无血清培养系统中口腔癌患者活化淋巴细胞的 iPS 细胞的建立及其治疗应用

基本信息

批准号：
16H07003
负责人：
赤木恵理
金额：
$ 1.91万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-08-26 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培養条件で誘導したヒトiPS細胞(hiPSC)を細胞傷害活性の高いリンパ球に再分化させ大量培養し、口腔癌の免疫細胞治療へ応用することを目的としている。本年度は、インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培養条件での末梢血単核球(PBMC)由来hiPSCの誘導法の効率化を検討した。口腔癌患者から採取したPBMCを、IL-2を添加した無血清培地RD5F(当研究室で開発)にて初代培養を行い増殖した活性化リンパ球にインテグレーションフリーのセンダイウイルスベクターSeVdpを用いて初期化4遺伝子を導入し、無血清培地hESF9(当研究室で開発)を用いてlaminin-E8上に播種しPBMC由来hiPSCを樹立した。更に効率よくhiPSCを誘導するために条件検討を行った。①分離したPBMCを0、3、6日の各日数で初代培養しSeVdpに感染させた。②SeVdp感染時のMOIを3、6、9の各種濃度とした。③SeVdp感染後の細胞を100000、200000、500000 cells/wellの各密度で6wellプレート1wellに播種した。これらの条件検討から、PBMCを6日間初代培養し、SeVdpをMOI6で感染させ、100000 cells/wellの密度で播種した条件が最も効率良くhiPSCを誘導できることが示された。さらに誘導されたPBMC由来hiPSCの未分化性の評価をRT-PCR法および蛍光免疫染色法にて検討した。誘導されたhiPSCは未分化マーカー遺伝子および蛋白発現を示した。また三胚葉への分化多能性をin vitroでは胚様体培養法を用い、in vivoではSCID mouseでのテラトーマ形成能を用いて評価したところ、いずれにおいても三胚葉への分化能を有していた。

The aim of this study is to induce high levels of cytotoxic activity in hiPSC cells under serum-free culture conditions and to redifferentiate them into mass cultures for use in immunotherapy of oral cancer. This year, the efficiency of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) derived from hiPSC was investigated under serum-free culture conditions. PBMC and IL-2 were added to serum-free culture RD5F (when the laboratory was developed), primary culture was used for proliferation, activation of the cells, and initiation of 4-gene introduction, serum-free culture hESF9 (when the laboratory was developed), laminin-E8 was used for seeding PBMC and hiPSC was established. The condition of hiPSC was discussed. 1. PBMC isolated on day 0, 3 and 6 of primary culture. 2. MOI 3, 6 and 9 of SeVdp infection were detected at various concentrations.③SeVdp infected cells were seeded at 6well densities of 10000,20000,50000 cells/well. The conditions for the induction of hiPSC were: PBMC 6 days in culture, SEVdp 6 days in infection, density of 100000 cells/well, seeding conditions 6 days in culture, and the highest rate of hiPSC induction. In addition, the undifferentiation of induced PBMCs from hiSCs was evaluated by RT-PCR and fluorescence immunostaining. The hiPSC was induced to differentiate and express protein. The pluripotency of triblastula in vitro, in vivo and SCID mouse