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RNA代謝に着目したポリグルタミン病の病態解明

阐明以 RNA 代谢为重点的多聚谷氨酰胺疾病的病理学

基本信息

批准号：
17H06843
负责人：
宮崎雄
金额：
$ 1.75万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-08-25 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17H06843/
关键词：
遺伝子核酸神経科学脳神経疾患

项目摘要

これまでの予備実験において、RNA結合タンパク質のCELF3が脊髄小脳失調症1型の原因遺伝子Ataxin 1 mRNAと結合することを確認している。今年度、ポリグルタミン病の培養細胞モデルを用いた実験では、CELF3が脊髄小脳失調症1型のみならず、脊髄小脳失調症3型とハンチントン病の各原因遺伝子のmRNAの発現も制御することを見出した。これは、一つのRNA結合タンパク質が複数のポリグルタミン病の原因遺伝子の発現を制御する可能性をもつものである。これらのポリグルタミン病の原因遺伝子のmRNAとCELF3の結合が特異的なものであるかを検証するために、現在、Ataxin 1 mRNAをモデルとして、mRNA内のCELF3結合部位の同定に取り組んでいる。具体的には、Ataxin 1 mRNAと、GFP Tagタンパク質を付加したCELF3を一過性強制発現により共発現させたヒトHEK293T細胞およびマウス神経系Neuro2A細胞のlysateを用いて、まず抗GFP抗体によるRNA免疫沈降法でRNA-タンパク質複合体を沈降する。その後、このRNA-タンパク質複合体からRNAを分離・精製し、精製したRNAを用いてRNA-seqを行いAtaxin 1 mRNA配列上のCELF3の結合部位を推定する。続いて、推定されたCELF3の結合部位の塩基配列を置換した変異型Ataxin 1 mRNAを発現するplasmidを作製し、in vitro結合実験におけるRNA免疫沈降法と定量的RT-PCRによって、CELF3が変異型Ataxin 1 mRNAには結合しないことを確認する。

Ataxin 1, the cause of spinal cord disorder type 1 The binding of mRNA is confirmed by binding. This year, the use of cultured cells for the disease, CELF3 and spinal cord disorder type 1 The various causes of the disease, spinal cord disorder type 3, and the disease are all caused by the disease.これは, 一つのRNA combined with タンパクquality がplural のポリグルタミン Disease のCause legacy 伝子の発 appear をcontrol する possibility をもつものである. The cause of これらのポリグルタミン disease, the specific なものであるかを検证するために, now, Ataxin 1 The mRNA is the same as the CELF3 binding site in the mRNA. Specific には, Ataxin 1 mRNA と, GFP Tag タンパクquality をpaid加したCELF3をtransient forced 発appear により合発appear させたヒトHEK293T cells およびマウス神経 Line Ne The uro2A cells were lysated using the RNA immunoprecipitation method using anti-GFP antibodies and RNA-DNA complexes. The RNA-seq plasmid complex was isolated and purified, and the purified RNA was isolated and purified using RNA-seq. Ataxin 1 mRNA was aligned on the CELF3 binding site and was presumed.続いて, presumed されたCELF3's binding site の塩 radical arrangement を replacement した変 isotype Ataxin 1 mRNA を発appear するplasmid をし, in In vitro combined RNA immunoprecipitation and quantitative RT-PCR, CELF3 allotype Ataxin 1 mRNA combined with confirmed.