RNA代謝に着目したポリグルタミン病の病態解明

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これまでの予備実験において、RNA結合タンパク質のCELF3が脊髄小脳失調症1型の原因遺伝子Ataxin 1 mRNAと結合することを確認している。今年度、ポリグルタミン病の培養細胞モデルを用いた実験では、CELF3が脊髄小脳失調症1型のみならず、脊髄小脳失調症3型とハンチントン病の各原因遺伝子のmRNAの発現も制御することを見出した。これは、一つのRNA結合タンパク質が複数のポリグルタミン病の原因遺伝子の発現を制御する可能性をもつものである。これらのポリグルタミン病の原因遺伝子のmRNAとCELF3の結合が特異的なものであるかを検証するために、現在、Ataxin 1 mRNAをモデルとして、mRNA内のCELF3結合部位の同定に取り組んでいる。具体的には、Ataxin 1 mRNAと、GFP Tagタンパク質を付加したCELF3を一過性強制発現により共発現させたヒトHEK293T細胞およびマウス神経系Neuro2A細胞のlysateを用いて、まず抗GFP抗体によるRNA免疫沈降法でRNA-タンパク質複合体を沈降する。その後、このRNA-タンパク質複合体からRNAを分離・精製し、精製したRNAを用いてRNA-seqを行いAtaxin 1 mRNA配列上のCELF3の結合部位を推定する。続いて、推定されたCELF3の結合部位の塩基配列を置換した変異型Ataxin 1 mRNAを発現するplasmidを作製し、in vitro結合実験におけるRNA免疫沈降法と定量的RT-PCRによって、CELF3が変異型Ataxin 1 mRNAには結合しないことを確認する。