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RNA代謝に着目したポリグルタミン病の病態解明

阐明以 RNA 代谢为重点的多聚谷氨酰胺疾病的病理学

基本信息

批准号：
17H06843
负责人：
宮崎雄
金额：
$ 1.75万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-08-25 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17H06843/
关键词：
遺伝子核酸神経科学脳神経疾患

项目摘要

これまでの予備実験において、RNA結合タンパク質のCELF3が脊髄小脳失調症1型の原因遺伝子Ataxin 1 mRNAと結合することを確認している。今年度、ポリグルタミン病の培養細胞モデルを用いた実験では、CELF3が脊髄小脳失調症1型のみならず、脊髄小脳失調症3型とハンチントン病の各原因遺伝子のmRNAの発現も制御することを見出した。これは、一つのRNA結合タンパク質が複数のポリグルタミン病の原因遺伝子の発現を制御する可能性をもつものである。これらのポリグルタミン病の原因遺伝子のmRNAとCELF3の結合が特異的なものであるかを検証するために、現在、Ataxin 1 mRNAをモデルとして、mRNA内のCELF3結合部位の同定に取り組んでいる。具体的には、Ataxin 1 mRNAと、GFP Tagタンパク質を付加したCELF3を一過性強制発現により共発現させたヒトHEK293T細胞およびマウス神経系Neuro2A細胞のlysateを用いて、まず抗GFP抗体によるRNA免疫沈降法でRNA-タンパク質複合体を沈降する。その後、このRNA-タンパク質複合体からRNAを分離・精製し、精製したRNAを用いてRNA-seqを行いAtaxin 1 mRNA配列上のCELF3の結合部位を推定する。続いて、推定されたCELF3の結合部位の塩基配列を置換した変異型Ataxin 1 mRNAを発現するplasmidを作製し、in vitro結合実験におけるRNA免疫沈降法と定量的RT-PCRによって、CELF3が変異型Ataxin 1 mRNAには結合しないことを確認する。

This is the first time that we have identified the presence of Ataxin 1 mRNA binding to CELF3, the causative gene of spinal cord dysfunction type 1. This year, CELF3 was used to control the mRNA expression of various causative genes of spinal cord disorders type 1, type 3, and type 4. This means that there is a possibility that RNA binding agents may be involved in controlling the occurrence of multiple RNA binding agents. The binding of CELF3 to mRNA of the causative gene of Ataxin 1 is specific to the detection of Ataxin 1 mRNA and the identification of CELF3 binding sites within mRNA. Specifically, Ataxin 1 mRNA, GFP Tag and protein were increased and CELF3 was detected during transient stress. HEK293 T cells were also detected during transient stress. Lysates from Neuro2A cells were detected by RNA immunoprecipitation assay using anti-GFP antibodies. The RNA-seq sequence was used to isolate, purify, and purify RNA from RNA-derived protein complexes. The binding site of CELF3 on the Ataxin 1 mRNA alignment was estimated. In addition, the plasmid expression of the putative CELF3 variant Ataxin 1 mRNA was confirmed by quantitative RT-PCR using RNA immunoprecipitation in vitro binding.