Analysis of activation mechanism of OPN4, a photoreceptor for circadian entrainment

昼夜节律光感受器 OPN4 激活机制分析

• 批准号: 18H06042
• 负责人: 木股 直規
• 金额: $ 1.91万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-08-24 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H06042/
• 关键词: 光受容; OPN4

非視覚系の光応答を担う光受容分子OPN4の活性化メカニズムをアミノ酸残基レベルで解明するため、マウスOPN4の変異体解析を行っている。着目したアミノ酸残基がOPN4の光活性化メカニズムに重要であることを確かめるには、発現するOPN4分子数に対する細胞の光応答を測定する必要がある。そこで、細胞に発現した野生型と変異型OPN4の発現量を比較するため、C末端に蛍光タンパク質mCherryが結合したOPN4（OPN4-mCherry）を作製した。OPN4-mCherryを発現させた培養細胞の光応答を観測したところ、野生型OPN4を発現させたものと同様の光応答を示したことから、OPN4-mCherryを変異体解析のコントロールに使用できることがわかった。そこで、脊椎動物ロドプシンの光活性化に重要なアミノ酸残基であるY191およびY268に着目し、これらに相当するOPN4のアミノ酸残基(Y224およびY309)についての変異体(Y224FおよびY309F)を作製した。これらの変異体を培養細胞に遺伝子導入したところ、両変異体ともに発現が確認できた一方で、野生型を発現した細胞とは異なる光応答を示した。この結果から、Y224およびY309がOPN4の光活性化メカニズムに関わるアミノ酸残基であることを見出した。また、OPN4の光活性化メカニズムの生理的な意義を見出すため、アデノ随伴ウイルス（AAV）を用いてマウスの光感受性網膜神経節細胞（ipRGC）に変異体OPN4を発現させることを計画している。そのために、まずは感染した細胞で組み換え酵素Cre依存的に野生型OPN4-mCherryを発現させるAAVを作製した。その結果、マウスipRGCに感染させる上で十分な力価のAAVを得られた。

Not see 覚 の 応 answer を bear う light by the capacity of molecular OPN4 の activeness メ カ ニ ズ ム を ア ミ ノ acid residues レ ベ ル で interpret す る た め, マ ウ ス OPN4 の line 1 - analytic を っ て い る. The mesh し た ア ミ ノ acid residues が OPN4 の optical activeness メ カ ニ ズ ム に important で あ る こ と を か indeed め る に は, 発 す る OPN4 number of molecules に す seaborne る cells の light 応 answer を determination す る necessary が あ る. そ こ で, cell に 発 now し た wild-type と - alien OPN4 の 発 quantity を now compare す る た め, C terminal に 蛍 light タ ン パ ク qualitative mCherry が combining し た OPN4 (OPN4 mCherry を cropping し た. OPN4 - mCherry を 発 now さ せ た culture cell の light 応 answer を 観 measuring し た と こ ろ, wild type OPN4 を 発 now さ せ た も の と with others の light 応 answer を shown し た こ と か ら, OPN4 mCherry を - variant parsing の コ ン ト ロ ー ル に use で き る こ と が わ か っ た. そ こ で, vertebrate ロ ド プ シ ン の optical activeness に important な ア ミ ノ acid residues で あ る Y191 お よ び Y268 に mesh し, こ れ ら に quite す る OPN4 の ア ミ ノ acid residues (Y224 お よ び Y309) に つ い て の - variants (Y224F お よ び Y309F) を cropping し た. こ れ ら の - variant を culture cell に posthumous son 伝 import し た と こ ろ, struck - variant と も に 発 が now confirmed で き た で, wild type を 発 now し た cells と は different な る light 応 answer を shown し た. こ の results か ら, Y224 お よ び Y309 が OPN4 の optical activeness メ カ ニ ズ ム に masato わ る ア ミ ノ acid residues で あ る こ と を shows し た. ま た, OPN4 の optical activeness メ カ ニ ズ ム の physiological significance な を see out す た め, ア デ ノ with accompanying ウ イ ル ス (AAV) を い て マ ウ ス の light sensitivity god 経 retinal ganglion cells (ipRGC) に - variant OPN4 を 発 now さ せ る こ と を project し て い る. そ の た め に, ま ず は infection し た み change with cell で え enzyme Cre dependent に wild-type OPN4 - mCherry を 発 now さ せ る AAV を cropping し た. そ の results, マ ウ ス ipRGC に infection さ せ る で very な force 価 の AAV を must ら れ た.