Bcl2-L-13の心臓におけるマイトファジー制御機構の解明と創薬への応用

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in vitroの実験においては、前年度に確立したラット新生仔単離心筋細胞（NRCM）を用いたhypoxia-reoxigenation（HR）の系についてさらに検討を行った。in vitroでのマイトファジー実験を効率よく行っていくには、現在行っている蛍光免疫染色によるマイトファジーの検出よりも、マイトファジーの誘導によるミトコンドリア分解をミトコンドリアタンパク質の減少もしくは、ミトコンドリアDNA（mtDNA）の減少により検出できることが望ましい。昨年検討したHRの条件において、ミトコンドリアタンパク質をWesten blottingで、mtDNAを定量PCRで評価したが、HRによる減少を検出することは出来なかった。タンパク質合成の影響を考え、クロラムフェニコールによるミトコンドリアタンパク質合成阻害下で同実験を行ったが、やはり検出は難しかった。より強い刺激が必要と考え、現在、HR条件の再検討を行っている。アミノ酸欠失培地の使用及び低酸素時間の延長により、以前より多くのマイトファジーを誘導できることが可能であった。細胞死についても評価しており、in vivoでの虚血再灌流をmimicするのに最適な条件を決定する。in vivoの実験においては、Bcl2-L-13ノックアウトマウスラインの確立には成功したものの、Bcl2-L-13+/+マウスの産生数が少なかった。虚血・再灌流手術の手技が確立できたため、予備実験として野生型マウスを購入してノックアウトマウスと比較した。冠動脈結紮45分の後、結紮を解除し、24時間後に心エコーによる心機能評価及びTTC染色による梗塞領域の評価を行った。梗塞領域および左室短縮率において野生型マウスとノックアウトマウスの間に有意な差異を認めた。