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心臓におけるミトコンドリア分解制御機構の解明と心不全治療薬創薬に向けた基礎的検討

阐明心脏中线粒体分解控制机制以及治疗心力衰竭药物开发的基础研究

基本信息

批准号：
22K16102
负责人：
村川智一
金额：
$ 3万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

in vivo実験として、Bcl2-L-13 S272Aノックインマウスを用いて横行大動脈縮窄術（TAC）による圧負荷誘導性心不全モデルを作製した。手術後１週、２週、４週で心エコーを行い、４週目で臓器重量のデータを計測するとともに、タンパク質・RNA・組織評価のためのサンプルを採取した。ノックインマウスでは、野生型マウスに比してTACにより左室短縮率の低下及び心重量の増加傾向を認めた。in vitro実験については、Bcl2-L-13 Ser272の責任kinaseを探索するため、siRNAライブラリのスクリーニングを進めている。あらかじめ96 well plateにsiRNA及びtranfection試薬を分注しておき、HA-Bcl2-L-13恒常発現HEK293A細胞を播種することでリバーストランスフェクションを行った。72時間後にCCCPを投与した後、抗p-Bcl2-L-13(Ser272)抗体による蛍光免疫染色を行った。Keyence BZ-X700のウェルスキャン機能を用いて自動撮影を行い、p-Bcl2-L-13(Ser272)陽性シグナルをカウントした。Image Jにより陽性シグナル数を計測し、シグナル数の減少が見られるものを候補として残すこととした。DMSO投与群に対してCCCP投与群で確実にシグナル数の増加が見られたことから、スクリーニングシステムが確立できたと考え、ライブラリスクリーニングを開始している。このライブラリは、708の遺伝子を含んでおり、全解析に39枚の96wellプレートの評価が必要である。現在約半数を超えるプレートにつき撮影を終了している。

Bcl2-L-13S272A can be used to control stress induced cardiac insufficiency by transarterial constriction (TAC). 1 week, 2 weeks, 4 weeks after surgery, the weight of the organ was measured, and the quality of the tissue was evaluated. The tendency of left ventricular shortening to decrease and cardiac weight to increase was recognized when compared with TAC. In vitro detection of Bcl2-L-13 Ser272 responsible kinase, siRNA detection and detection HA-Bcl-2-L-13 is constantly detected in HEK293A cells. After 72 hours of CCCP administration, anti-p-Bcl 2-L-13(Ser272) antibody was used for immunostaining. Keyence BZ-X700 has the function of automatic image detection, p-Bcl2-L-13(Ser272) positive image detection. The number of positive cells is measured, and the number of cells is reduced. The number of DMSO-treated groups increases with CCCP-treated groups. The number of DMSO-treated groups increases with 708 pieces of information are included in the complete analysis, 39 pieces of information are included in the 96-well analysis, and evaluation is necessary. Now about half of the photos are over.