DNAバーコーディング法による毒キノコ鑑別法の確立

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本研究は、有毒キノコによる食中毒事案を想定し、試料から得られたDNA塩基配列によって中毒原因のキノコを推定する手法（DNAバーコーディング法）を検討するものである。令和4年度は、調理及び消化の影響を受けた試料に対する適用を検討した。先行研究において、調理時の高温及び消化時の低pHに曝された嘔吐物又は胃内容物は、そのDNAが断片化し、解析対象領域のPCRが困難になることが報告されている。そこで、本研究では、従来解析対象であったinternal transcribed spacer 1 (ITS1)領域より「短い」領域を新たな解析対象とすることで、DNA分解試料に対するPCR及び配列解析の成功率を向上させることを目指した。まず、新たな解析対象領域として、(1)真正担子菌綱に普遍的に存在し、 (2)種間変異に富み、(3)ITS1領域（200-300 bp）より短い遺伝子領域を検索したところ、translation elongation factor 1-alpha (tef1a)遺伝子のイントロンの一つ（約110 bp）が見出された。当該イントロンを標的としたPCRの可否を検討すべく、エリンギ・マイタケ・アミタケ・アラゲキクラゲ・チチタケ試料より抽出したDNAについてPCRを試みたところ、いずれも増幅が確認された。これらPCR産物の塩基配列を決定し、公共塩基配列データベース（Genbank）を対象として類似配列を検索したところ、対応する種に由来する配列がヒットした。さらに、DNA分解試料における当該イントロン及びITS1のPCR成否を比較すべく、エリンギを炒めた又は茹でた試料及びこれらを最大５時間模擬胃液で消化した試料についてPCRを試みたところ、５時間消化時点でITS１の増幅が確認されなくなった一方、当該イントロンは依然として増幅が確認された。