天然物生合成機構の改変による革新的ペプチド－核酸融合化合物ライブラリーの構築

修改天然产物生物合成机制构建创新肽-核酸融合化合物库

• 批准号: 22K20567
• 负责人: 白石 太郎
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20567/
• 关键词: 天然物化学; 核酸系化合物; 放線菌; 化合物ライブラリー

本年度はまず、核酸－ペプチド融合化合物創出系構築の基盤を確立するため、ペプチド構造を含む小タンパク質の放線菌における発現系の構築を試みた。最初に生産菌である放線菌を宿主として用いてヒスチジンタグを付加した酵素の発現系を構築し、Ni-NTAカラムによる精製を試みた。しかしながら目的タンパク質を得ることはできなかった。そこで次に汎用宿主であるS. lividans TK23株を用いた発現系の構築を行なった。構築した異種発現株を用いて発現条件検討を行い、目的タンパク質の精製を試みた。その結果、目的とする小タンパク質の良好な取得に成功した。今後は異種発現宿主を用いて改変生合成系の再構築を行う。また各種組換え酵素とペプチダーゼを用いたin vitro反応を試みた結果、目的とする核酸-ペプチド融合化合物と一致する分子量と思われる化合物の形成を確認した。このことから少なくともin vitroでは計画した合成系が有効に働くことが示された。また、これら組換え酵素と小タンパク質の変異体を用いて縮合反応の検証を行なった。その結果、本縮合反応においては小タンパク質のC末端部位の鎖長に対してはある程度の寛容であることが明らかとなった。一方で、一部の高度に保存されているC末端の酸性アミノ酸残基について変異を導入すると全く活性が損なわれることが明らかとなった。本研究で対象としている核酸とペプチドの縮合反応を触媒する酵素の構造生物学的知見を得るために各種条件による結晶化を試みた。小タンパク質との共発現系を用いて精製した複合体や各種単体酵素を用いて結晶化スクリーニングを行なったものの、現在までに良質な結晶の取得には至っていない。

This year, the foundation for the creation of nucleic acid-nucleic acid-condensation fusion compounds has been established. , ペプチドstructuralをcontainingむsmallタンパクqualityのactinomycetesにおける発出款のstructuralをtestみた. Initially, the production strain, Actinomycetes, was used as the host for the actinomycetes. Ni-NTA Enzyme's current system is constructed, and Ni-NTA's refined enzyme is tested.しかしながらpurposeタンパク性をget ることはできなかった. The common host is the common host S. lividans TK23 strain. The construction of the heterogeneous strain is carried out using the current conditions and the purpose of the test.そのResult, purpose, とする小タンパクquality, のGood, なachievedにsuccessした. From now on, if the alien species appears as a host, it will be rebuilt using the synthetic system. Various combinations of enzymes and enzymes are used The results of the in vitro reaction test, the target nucleic acid-condensation fusion compound, the consistent molecular weight, and the formation of the target nucleic acid-containing compound were confirmed.このことから小なくともin vitroではPlan した Synthetic system がeffective に働くことが Show された. The また, これら group replaces the え enzyme and the small タンパク quality の変 variant を uses the いて condensation reaction 応の検证を行なった. The result of this condensation reaction is the C-terminal part of the small タンパクquality The length of the lock is the same as the length of the lock. One side and one side have highly conserved acid residues at the C-terminus.いて変different を Import すると全くActivity がloss なわれることが明らかとなった. This study is based on knowledge of the structural biology of nucleic acid, condensation, reaction, catalyst, and enzyme, as well as experiments on crystallization under various conditions. The small タンパク品との公発市を用いて refined した complex and various single enzymes are crystallized with いてスクリーニングを行なったものの、Now までにGood quality なcrystallization には to っていない.