天然物生合成機構の改変による革新的ペプチド－核酸融合化合物ライブラリーの構築

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本年度はまず、核酸－ペプチド融合化合物創出系構築の基盤を確立するため、ペプチド構造を含む小タンパク質の放線菌における発現系の構築を試みた。最初に生産菌である放線菌を宿主として用いてヒスチジンタグを付加した酵素の発現系を構築し、Ni-NTAカラムによる精製を試みた。しかしながら目的タンパク質を得ることはできなかった。そこで次に汎用宿主であるS. lividans TK23株を用いた発現系の構築を行なった。構築した異種発現株を用いて発現条件検討を行い、目的タンパク質の精製を試みた。その結果、目的とする小タンパク質の良好な取得に成功した。今後は異種発現宿主を用いて改変生合成系の再構築を行う。また各種組換え酵素とペプチダーゼを用いたin vitro反応を試みた結果、目的とする核酸-ペプチド融合化合物と一致する分子量と思われる化合物の形成を確認した。このことから少なくともin vitroでは計画した合成系が有効に働くことが示された。また、これら組換え酵素と小タンパク質の変異体を用いて縮合反応の検証を行なった。その結果、本縮合反応においては小タンパク質のC末端部位の鎖長に対してはある程度の寛容であることが明らかとなった。一方で、一部の高度に保存されているC末端の酸性アミノ酸残基について変異を導入すると全く活性が損なわれることが明らかとなった。本研究で対象としている核酸とペプチドの縮合反応を触媒する酵素の構造生物学的知見を得るために各種条件による結晶化を試みた。小タンパク質との共発現系を用いて精製した複合体や各種単体酵素を用いて結晶化スクリーニングを行なったものの、現在までに良質な結晶の取得には至っていない。