遺伝子組換え不要のゲノム編集リンゴ作出に向けた基盤技術開発

これまでのリンゴでのゲノム編集技術は遺伝子組換えを必要とするため、本研究では、ゲノムに組み込まれず自己複製する環状化DNAを用いた発現系のリンゴへの適用と、再分化促進因子を利用したゲノム編集個体の再生・選抜系の確立により、遺伝子組換えを必要としないゲノム編集系の開発を目標としている。環状化DNAの利用について、本年度はジェミニウイルスの一種である、ダイズ黄色矮化ウイルス（BeYDV）由来の配列を利用したベクターを構築して、植物細胞内で発現系の環状化が可能であるかを検証した。Cas9およびgRNAの発現系を含む一体型ベクターをリンゴに導入したところ、リンゴでもDNAの環状化が確認できた。しかし、環状化の効率が低く、またゲノム編集による変異導入が確認できなかった。BeYDVのゲノムサイズは4 kb程度であるが、構築した一体型ベクターは20 kb以上であったことから、環状化の効率が低い要因としてベクターサイズが考えられた。そのため、各発現系を異なるベクターに搭載して、複数の小型ベクターを用いる系を作成して、機能を検証している。再分化の促進については、近年、再分化を促進する因子であるWUSおよびBBM1と、CRISPR/Cas9を組み合わせたゲノム編集手法が様々な植物種で報告されている。リンゴにおける相同遺伝子であるMdWOX4-2とMdBBM1も再分化促進能を有することが明らかにされたため、これらの遺伝子をリンゴで過剰発現させる発現コンストラクトを構築した。当初は上述の一体型ベクターに、これらの再分化因子を同時に搭載するシステムを構築したが、ゲノム編集による変異導入・再分化ともに確認できなかったため、発現系を分割して小型化したベクターを作成した。また、BeYDVの配列を用いてこれらの再分化促進因子も環状化して発現量を向上させる系を構築した。

これまでのリンゴでのゲノム編集技術は遺伝子組換えを必要とするため、本研究では、ゲノムに組み込まれず自己複製する環状化DNAを用いた発現系のリンゴへの適用と、再分化促進因子を利用したゲノム編集個体の再生・選抜系の確立により、遺伝子組換えを必要としないゲノム編集系の開発を目標としている。環状化DNAの利用について、本年度はジェミニウイルスの一種である、ダイズ黄色矮化ウイルス（BeYDV）由来の配列を利用したベクターを構築して、植物細胞内で発現系の環状化が可能であるかを検証した。Cas9およびgRNAの発現系を含む一体型ベクターをリンゴに導入したところ、リンゴでもDNAの環状化が確認できた。しかし、環状化の効率が低く、またゲノム編集による変異導入が確認できなかった。BeYDVのゲノムサイズは4 kb程度であるが、構築した一体型ベクターは20 kb以上であったことから、環状化の効率が低い要因としてベクターサイズが考えられた。そのため、各発現系を異なるベクターに搭載して、複数の小型ベクターを用いる系を作成して、機能を検証している。再分化の促進については、近年、再分化を促進する因子であるWUSおよびBBM1と、CRISPR/Cas9を組み合わせたゲノム編集手法が様々な植物種で報告されている。リンゴにおける相同遺伝子であるMdWOX4-2とMdBBM1も再分化促進能を有することが明らかにされたため、これらの遺伝子をリンゴで過剰発現させる発現コンストラクトを構築した。当初は上述の一体型ベクターに、これらの再分化因子を同時に搭載するシステムを構築したが、ゲノム編集による変異導入・再分化ともに確認できなかったため、発現系を分割して小型化したベクターを作成した。また、BeYDVの配列を用いてこれらの再分化促進因子も環状化して発現量を向上させる系を構築した。