光遺伝学とクライオ電子線トモグラフィーを用いた神経細胞極性形成期の細胞骨格研究

使用光遗传学和冷冻电子断层扫描进行神经元极性形成过程中的细胞骨架研究

• 批准号: 22K20680
• 负责人: 吉原 壮悟
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20680/
• 关键词: 細胞骨格; クライオ電子線トモグラフィー; 光遺伝学; アクチン; 細胞極性; Rac1

脳の情報処理機能を司る神経細胞の極性形成には、アクチンや微小管などの細胞骨格ネットワークが重要な役割を担っている。しかし、現在の光学顕微鏡的実験系では、極性形成過程を細胞内で観察することは困難であり、その分子機構の解明はほとんど進んでいない。そこで本研究では、光遺伝学とクライオ電子線トモグラフィー(Cryo-ET)とを組み合わせたタイムラプスCryo-ET法により、細胞骨格ネットワークの微細な形態変化過程を捉え、極性の形成機序や疾患の発症原因を解明することを目的としている。クライオ電子線トモグラフィーによる細胞骨格ネットワークの超微細構造解明のためには、グリッド上への細胞播種密度や接着条件、およびグリッド浸漬凍結装置の種類やその設定などを慎重に検討することが重要である。そこで本年度は、まず野生型海馬神経細胞を用いてこれらを精査し、その最適条件を得た。次に、極性形成過程の観察を行うべく、F-actinの蛍光標識であるLifeact-EGFPに加えて、アクチン繊維のネットワークを形成させる光遺伝学ツールPA-Rac1を海馬神経細胞に導入した。そして光照射時間による、ネットワークの活性化を定量的に解析した。得られたデータを用いて、Rac1活性化のタイムコースを設けた試料を浸漬凍結装置Vitrobotによって急速凍結し、様々な時期の試料を得ることに成功した。そして、試料を凍結したまま観察可能なクライオ蛍光顕微鏡Cryo EM CLEMを用いてグリッド全体を撮影し、PA-Rac1の発現と、Lifeact-EGFPの蛍光像から観察に適した部位を同定した。

The information processing function of the brain cell is responsible for the polarization of the brain cell. The present optical microscope system is difficult to detect in cells, polar processes and molecular mechanisms. The purpose of this study is to investigate the micromorphogenetic process of cytoskeleton development, the formation mechanism of polarity and the causes of disease. It is important to carefully examine the type and setting of the immersion freezing device for cell seeding density and adhesion conditions on the surface of the electron beam. This year, the optimal conditions for the use of wild-type hippocampal neurons were determined. In addition, the study of polarity formation process, F-actin fluorescence labeling, Lifeact-EGFP fluorescence labeling, F-actin fluorescence labeling, PA-Rac1 fluorescence labeling, and F-actin fluorescence labeling were introduced into hippocampal neurons. The quantitative analysis of the activation of the light irradiation time The test sample was successfully set up for rapid freezing by Vitrobot. For example, sample freezing may be detected by optical microscope Cryo EM CLEM, which may be used to detect all samples, PA-Rac1 detection, Lifeact-EGFP optical image detection, and the same location.