光遺伝学とクライオ電子線トモグラフィーを用いた神経細胞極性形成期の細胞骨格研究

使用光遗传学和冷冻电子断层扫描进行神经元极性形成过程中的细胞骨架研究

• 批准号: 22K20680
• 负责人: 吉原 壮悟
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20680/
• 关键词: 細胞骨格; クライオ電子線トモグラフィー; 光遺伝学; アクチン; 細胞極性; Rac1

脳の情報処理機能を司る神経細胞の極性形成には、アクチンや微小管などの細胞骨格ネットワークが重要な役割を担っている。しかし、現在の光学顕微鏡的実験系では、極性形成過程を細胞内で観察することは困難であり、その分子機構の解明はほとんど進んでいない。そこで本研究では、光遺伝学とクライオ電子線トモグラフィー(Cryo-ET)とを組み合わせたタイムラプスCryo-ET法により、細胞骨格ネットワークの微細な形態変化過程を捉え、極性の形成機序や疾患の発症原因を解明することを目的としている。クライオ電子線トモグラフィーによる細胞骨格ネットワークの超微細構造解明のためには、グリッド上への細胞播種密度や接着条件、およびグリッド浸漬凍結装置の種類やその設定などを慎重に検討することが重要である。そこで本年度は、まず野生型海馬神経細胞を用いてこれらを精査し、その最適条件を得た。次に、極性形成過程の観察を行うべく、F-actinの蛍光標識であるLifeact-EGFPに加えて、アクチン繊維のネットワークを形成させる光遺伝学ツールPA-Rac1を海馬神経細胞に導入した。そして光照射時間による、ネットワークの活性化を定量的に解析した。得られたデータを用いて、Rac1活性化のタイムコースを設けた試料を浸漬凍結装置Vitrobotによって急速凍結し、様々な時期の試料を得ることに成功した。そして、試料を凍結したまま観察可能なクライオ蛍光顕微鏡Cryo EM CLEMを用いてグリッド全体を撮影し、PA-Rac1の発現と、Lifeact-EGFPの蛍光像から観察に適した部位を同定した。

肌动蛋白和微管等细胞骨架网络在控制大脑的信息处理功能的神经元的形成中起着重要作用。但是，在当前的光学显微镜实验系统中，很难观察细胞内的极性形成过程，并且几乎没有阐明其分子机制。因此，本研究旨在通过使用延时的冷冻方法来掌握细胞骨架网络的细微形态变化，该方法结合了光遗传学和冷冻电子层析成像（冷冻-ET），并阐明极性形成的机制和疾病发展的原因。为了使用冷冻电子层析成像阐明细胞骨架网络的超微结构，仔细考虑在网格上的细胞接种密度和粘附条件以及网格浸入和冷冻设备的类型和设置非常重要。因此，今年，我们首先使用野生型海马神经元检查了这些，以获得最佳条件。接下来，为了观察极性形成过程，除了LifeActin的荧光标签外，还将形成肌动蛋白纤维网络的光遗传学工具PA-RAC1引入了海马神经元中。通过光照射时间定量分析网络的激活。使用所获得的数据，使用浸入冰柜玻璃体迅速冷冻具有RAC1激活的样品，并成功获得了样品。然后使用具有可观察到的冷荧光显微镜的冷冻荧光显微镜拍摄整个网格，并从PA-RAC1的表达和LifeAct-EGFP的荧光图像中鉴定出适当的观察位点。