シスプラチン耐性分子メカニズムに着目した新規免疫療法

关注顺铂耐药分子机制的新型免疫疗法

• 批准号: 22K20777
• 负责人: 水江 由佳
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: Sapporo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20777/
• 关键词: がん免疫; 抗体医薬; 人工抗体; がん抗原; 尿路上皮癌; 化学療法抵抗性; 抗体工学; 癌抗原; 膀胱癌

尿路上皮癌は、泌尿器系悪性腫瘍の中でも致死率が高い疾患である。シスプラチン（CDDP）を中心としたプラチナ製剤は尿路上皮癌治療のキードラッグとなるが、化学療法抵抗性が問題となる。我々は、化学療法抵抗性尿路上皮癌に対する有効な治療法開発を目的とし、リガンドーム解析による膀胱がん幹細胞からHLA-A*02:01拘束性のClaspinペプチド（HLA-A2/Claspinぺプチド）を癌抗原ペプチドのひとつとして同定した。さらに、膀胱がん細胞株（UM-UC-3）にCDDPを添加培養し続けることで樹立したCDDP耐性細胞（UM-UC-3 CR）でのClaspinの強発現、およびClaspin遺伝子をsiRNAで欠失した耐性細胞株のCDDPに対する感受性の増加を示し、CDDP耐性に対するClaspinの重要な関与を明らかとした。そこで、本研究では、細胞表面上に提示される‘HLA-A2/Claspinぺプチド’を認識する特異的人工抗体開発を目的とした。はじめに、抗体の抗原を認識する可変領域の断片である軽鎖可変領域と 重鎖可変領域を柔軟なをリンカー配列で連結し、Ｃ末端にHis-tagを結合させた一本鎖抗体（scFv）を基本構成とする複数の候補抗体クローンをファージディスプレイ法により獲得した。このHLA-A2/Claspinペプチド複合体特異的scFvのタンパク質を大腸菌より作製し、ELISA法により11種類の陽性クローンを選定した。次に、これら候補抗体scFvの中からフローサイトメトリーおよび免疫蛍光染色法を用い、Claspin ペプチドに対し、特異的かつ高い反応性を示すクローンを特定できた。さらに、特定した抗体はUM-UC-3 CR細胞を認識することを確認し、本研究で作製したscFv抗体がClaspinを高発現するCDDP耐性膀胱がん細胞に反応する特異的抗体である可能性を示した。

尿路上皮癌是泌尿性恶性肿瘤中最致命的疾病之一。铂制剂（主要是顺铂（CDDP））是尿路上皮癌治疗的关键药物，但抗化疗是一个问题。我们已经使用Ligandom分析将HLA-A*02：02：01限制的链蛋白肽（HLA-A2/ClassPin肽）鉴定为膀胱癌干细胞中的癌症抗原肽之一。此外，通过继续培养膀胱癌细胞系（UM-UC-3）建立的CDDP耐药细胞（UM-UC-3 CR）中，网蛋白的强烈表达表达，并提高了对CDDP耐药细胞系的敏感性，这些细胞已用siRNA删除了class蛋白基因，从而揭示了CLASPIN在CDDPPPPPPP的重要参与中。因此，这项研究旨在开发特定的人工抗体，以识别在细胞表面显示的“ HLA-A2/ClassPin肽”。首先，使用柔性接头序列连接光链可变区域，识别抗原的可变区域的片段和重链可变区域，具有柔性链接序列，并通过噬菌体显示与C-Terminus结合的单链抗体（SCFV）。该HLA-A2/ClassPin肽复合物特异性SCFV蛋白是从大肠杆菌制备的，ELISA选择了11个阳性克隆。接下来，在这些候选抗体SCFV中，使用流式细胞仪和免疫荧光染色鉴定出对链球蛋白肽的特异性和高度反应性的克隆。此外，我们证实了所鉴定的抗体识别UM-UC-3 CR细胞，表明本研究中产生的SCFV抗体是一种特异性抗体，是一种对表达高classpaspin的耐CDDP抗CDDP膀胱癌细胞反应的特定抗体。