シスプラチン耐性分子メカニズムに着目した新規免疫療法

关注顺铂耐药分子机制的新型免疫疗法

• 批准号: 22K20777
• 负责人: 水江 由佳
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: Sapporo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20777/
• 关键词: がん免疫; 抗体医薬; 人工抗体; がん抗原; 尿路上皮癌; 化学療法抵抗性; 抗体工学; 癌抗原; 膀胱癌

尿路上皮癌は、泌尿器系悪性腫瘍の中でも致死率が高い疾患である。シスプラチン（CDDP）を中心としたプラチナ製剤は尿路上皮癌治療のキードラッグとなるが、化学療法抵抗性が問題となる。我々は、化学療法抵抗性尿路上皮癌に対する有効な治療法開発を目的とし、リガンドーム解析による膀胱がん幹細胞からHLA-A*02:01拘束性のClaspinペプチド（HLA-A2/Claspinぺプチド）を癌抗原ペプチドのひとつとして同定した。さらに、膀胱がん細胞株（UM-UC-3）にCDDPを添加培養し続けることで樹立したCDDP耐性細胞（UM-UC-3 CR）でのClaspinの強発現、およびClaspin遺伝子をsiRNAで欠失した耐性細胞株のCDDPに対する感受性の増加を示し、CDDP耐性に対するClaspinの重要な関与を明らかとした。そこで、本研究では、細胞表面上に提示される‘HLA-A2/Claspinぺプチド’を認識する特異的人工抗体開発を目的とした。はじめに、抗体の抗原を認識する可変領域の断片である軽鎖可変領域と 重鎖可変領域を柔軟なをリンカー配列で連結し、Ｃ末端にHis-tagを結合させた一本鎖抗体（scFv）を基本構成とする複数の候補抗体クローンをファージディスプレイ法により獲得した。このHLA-A2/Claspinペプチド複合体特異的scFvのタンパク質を大腸菌より作製し、ELISA法により11種類の陽性クローンを選定した。次に、これら候補抗体scFvの中からフローサイトメトリーおよび免疫蛍光染色法を用い、Claspin ペプチドに対し、特異的かつ高い反応性を示すクローンを特定できた。さらに、特定した抗体はUM-UC-3 CR細胞を認識することを確認し、本研究で作製したscFv抗体がClaspinを高発現するCDDP耐性膀胱がん細胞に反応する特異的抗体である可能性を示した。

Urothelial cancer has a high mortality rate among both urothelial and urinary tract cancers. CDDP is a central issue in the treatment of urothelial cancer and chemotherapy resistance. We have developed effective therapies for chemotherapy-resistant urothelial cancer, including HLA-A*02:01 binding Claspin receptor (HLA-A2/Claspin receptor) cancer antigens. In addition, CDDP was added to the bladder cell line (UM-UC-3) in culture, and then CDDP-resistant cells (UM-UC-3CR) were established. Claspin was strongly expressed, and siRNA for Claspin gene was absent. The sensitivity of CDDP-resistant cell lines to Claspin was increased, and the important relationship between CDDP-resistant cells and Claspin was clarified. The aim of this study is to develop specific artificial antibodies to HLA-A2/Claspin antibodies that can be detected on cell surfaces. Antibodies can be identified in different domains. This HLA-A2/Claspin complex-specific scFv was produced by E. coli, and 11 species of positive scFv were selected by ELISA In addition, the candidate antibody scFv is used in the middle of the spectrum and immunofluorescence staining method, and the Claspin selection method is used in the middle of the spectrum. This study demonstrates the possibility of producing scFv antibodies specific to UM-UC-3 CR cells and to Claspin resistant bladder cells.