ツメガエル卵抽出液を用いたDNAメチル化制御機構の解析

利用非洲爪蟾卵提取物分析 DNA 甲基化控制机制

• 批准号: 23890175
• 负责人: 西山 敦哉
• 金额: $ 2.08万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011-08-24 至 2013-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-23890175/
• 关键词: DNAメチル化; Dnmt1; Uhrf1; DNA複製; ツメガエル卵抽出液; 翻訳後修飾

DNAのメチル化は、メチル化DNA結合タンパク質の働きを介してクロマチン構造を制御し、遺伝子の発現制御やクロマチン構造の安定化に重要な役割を果たしている。DNA複製時において、メチル化DNAの維持はDNA維持メチル化酵素1(Dnmt1)によって行われる。またDnmt1のメチル化部位へのリクルートにはヘミメチル化DNAを特異的に認識、結合するUhrf1が重要な役割を果たしており、これらの因子は正常な発生、ゲノムの安定性維持に必要である。本研究は、維持DNAメチル化の分子機構を明らかにするために、すでに確立された試験管内DNA複製系であるアフリカツメガエル卵抽出液由来の無細胞系を用いて行った。まずDNA複製時においてツメガエルDnmt1,Uhrf1の因子のクロマチン結合がどのように制御されているのか、様々なDNA複製阻害剤を用いて解析を行った。その結果、Dnmt1とUhrf1はいずれも分裂期のクロマチンには結合せず、間期、特にDNA合成が行われる時期にその結合のピークが見られた。このDnmt1のクロマチン結合は、Uhrf1の免疫除去により完全に抑制されたことから、ツメガエル卵無細胞系を用いてUhrf1/Dnmt1によるDNA維持メチル化機構を再現できることが示された。一方、DnmtAを抽出液から免疫除去すると、UhrfAのクロマチン結合量が大きく増加することが分かった。Uhrf1の蓄積は野生型のリコンビナントDnmt1蛋白質を抽出液に加え戻すことで解消されたことから、Dnmt1非存在下におけるヘミメチル化DNAの蓄積を介するものと考えられる。また我々は、Dnmt1を免疫除去した場合において、複数のクロマチン結合蛋白質が翻訳後修飾と思われる電気泳動上の移動度が観察されることを見出した。これはDnmt1のメチル化部位へのリクルート、または維持DNAメチル化の完了が何らかの形でモニターされている可能性を示唆しており、「現在その修飾を引き起こす分子機構、またその意義についてさらに解析を進めている。

DNA の メ チ ル は, メ チ ル turn DNA combine タ ン パ ク qualitative の 働 き を interface し て ク ロ マ チ ン tectonic を suppression し, but 伝 の 発 now suppression や ク ロ マ チ の ン structure stabilization に important な "を cut fruit た し て い る. When the DNA replication に お い て, メ チ ル の maintenance は DNA, the DNA メ チ ル phenoloxidase 1 (Dnmt1) に よ っ て line わ れ る. ま た Dnmt1 の メ チ ル change parts へ の リ ク ル ー ト に は ヘ ミ メ チ ル を specific DNA に understanding, combining す る Uhrf1 が important な "を cut fruit た し て お り, こ れ ら の factor は normal な 発 birth, ゲ ノ ム の stability maintaining に necessary で あ る. This study は, maintain DNA メ チ ル change の molecular institutions を Ming ら か に す る た め に, す で に establish さ れ た test tube DNA replication system で あ る ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル eggs extract origin の を with no cell line い て line っ た. When ま ず DNA replication に お い て ツ メ ガ エ ル Dnmt1, Uhrf1 の factor の ク ロ マ チ ン combining が ど の よ う に suppression さ れ て い る の か, others in 々 な DNA replication resistance against tonic を い analytical line を っ て た. そ の results, Dnmt1 と Uhrf1 は い ず れ も divide の ク ロ マ チ ン に は combining せ ず, interphase, に DNA synthesis が line わ れ る period に そ の combining の ピ ー ク が see ら れ た. こ の Dnmt1 の ク ロ マ チ ン は, Uhrf1 の immune to remove に よ り に completely inhibit さ れ た こ と か ら, ツ メ ガ エ ル を eggs without cell line with い て Uhrf1 / Dnmt1 に よ る DNA maintain メ チ ル change institutions を reappearance で き る こ と が shown さ れ た. Party, DnmtA を extract か ら immune to remove す る と, UhrfA の ク ロ マ チ ン combined with large quantity が き く raised plus す る こ と が points か っ た. Uhrf1 の accumulation は wild-type の リ コ ン ビ ナ ン ト を Dnmt1 protein extract に plus え 戻 す こ と で null さ れ た こ と か ら, Dnmt1, the presence of に お け る ヘ ミ メ チ ル change DNA の accumulation を interface す る も の と exam え ら れ る. ま た I 々 は, Dnmt1 を immune to remove し た occasions に お い て, plural の ク ロ マ チ ン binding protein modification after が turn 訳 と think わ れ る electric 気 swimming on の mobile degrees が 観 examine さ れ る こ と を shows し た. こ れ は Dnmt1 の メ チ ル change parts へ の リ ク ル ー ト, ま た は maintain DNA メ チ ル change what finished の が ら か の form で モ ニ タ ー さ れ て い を る possibility in stopping し て お り, "now そ の modified を lead き up こ す molecular institutions, ま た そ の meaning に つ い て さ ら に parsing を into め て い る.

项目成果

Essential roles of Xenopus TRF2 in telomere end protection and replication

非洲爪蟾 TRF2 在端粒末端保护和复制中的重要作用

• DOI: 10.1111/j.1365-2443.2011.01520.x
• 发表时间: 2011
• 期刊: Genes to Cells
• 影响因子: 2.1
• 作者: Muraki;K.
• 通讯作者: K.

DNA複製時におけるUhrf1とDnmt1による維持メチル化制御機構

DNA复制过程中Uhrf1和Dnmt1维持的甲基化控制机制

• 发表时间: 2012
• 作者: 山口留奈;西山敦哉;島村真太郎;石川冬木;中西真
• 通讯作者: 中西真