ヒト臍帯由来間葉系幹細胞を用いた新規骨再生療法の開発

利用人脐带间充质干细胞开发新的骨再生疗法

• 批准号: 24890087
• 负责人: 匠原 龍太郎
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-08-31 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24890087/
• 关键词: 間葉系幹細胞; 臍帯; 骨再生

申請者は名古屋大学倫理委員会の承認を受けて、産婦人科学講座の協力をもとに帝王切開及び正常分娩の臍帯の供給を受け、これまでに得られた臍帯から同時に３種類の細胞（WJMSC・血管内皮細胞・造血幹細胞）を分離培養することに成功した。採取した臍帯血を比重遠心にて単核球分画を分離したのち磁気細胞分離装置にてCD34陽性造血幹細胞を分離した。造血幹細胞は造血幹細胞増殖培地にて拡大培養を行い、フローサイトメーターによる細胞表面抗原の解析によってCD34陽性CD45弱陽性な造血幹細胞が採取できていることを確認した。血管内皮細胞は臍帯静脈の内面をトリプシン処理し採取したのち血管内皮増殖因子添加増殖培地にて拡大培養後、CD31陽性、CD45陰性の典型的な臍帯静脈由来血管内皮細胞が採取できていることを確認した。WJMSC粗分画は血管周囲の臍帯間質Wharton’s jelly をヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ処理したのち、細胞接着特性によって採取した。細胞増殖試験を行い、WJMSCの高い増殖能を確認した。WJMSCの多分化能に関しては、通常の分化誘導プロトコールにしたがって骨・軟骨・脂肪・神経細胞への分化能を確認した。さらにWJMSCの骨前駆細胞への分化能を解析した。UCMSCを骨分化誘導培地に50～100ng/ml のBMP-2を添加して１週間培養した結果、アルカリフォスファターゼ活性の有意な上昇を認めた。また骨分化誘導培地に100ng/ml のBMP-2を添加して培養した結果、骨前駆細胞マーカー遺伝子であるRUNX2, Osteocalcinが発現することがわかった。よって骨分化誘導培地にBMP-2を添加することによってWJMSCを短期間で骨前駆細胞に分化誘導させることができることがわかった。

The applicant received approval from the Nagoya University Ethics Committee and was provided with the support of the Obstetrics and Gynecology Department, with the help of the Obstetrics and Gynecology Department, and was able to simultaneously separate and cultivate three types of cells (WJMSCs, vascular endothelial cells, and hematopoietic stem cells) from the umbilical cord obtained so far.通过特定的重力离心分离收集的脐带血，然后通过磁细胞分离装置分离单核细胞分数。造血干细胞在造血干细胞生长培养基中培养，并证实可以通过使用流式细胞仪分析细胞表面抗原来收集CD34阳性CD45阳性造血干细胞。对血管内皮细胞进行胰蛋白酶细胞，然后在补充血管内皮生长因子的生长培养基中膨胀，并确认典型的脐静脉衍生的血管内皮细胞（CD31阳性和CD45阴性）收集。 WJMSC粗馏分是由血管周围脐带间质沃顿的果冻收集的，该果冻用透明质酸酶和胶原酶处理，然后是细胞粘附特性。进行细胞增殖测试以确认WJMSC的高增殖能力。关于WJMSC的多功能潜力，根据正常的分化诱导方案确认了骨，软骨，脂肪和神经元的分化能力。此外，分析了WJMSC分化为成骨祖细胞细胞的能力。将UCMSC培养为一周，在骨分化诱导培养基中添加50-100 ng/ml的BMP-2，发现碱性磷酸酶活性显着增加。此外，将100 ng/ml的BMP-2添加到骨分化诱导培养基并培养中，发现Runx2和骨钙素（标记基因）表达了标记基因，并诱导了骨祖细胞。因此，发现可以通过将BMP-2添加到骨分化诱导培养基中，可以在短时间内将WJMSC在短时间内诱导成成骨的祖细胞。