ヒト臍帯由来間葉系幹細胞を用いた新規骨再生療法の開発

利用人脐带间充质干细胞开发新的骨再生疗法

• 批准号: 24890087
• 负责人: 匠原 龍太郎
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-08-31 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24890087/
• 关键词: 間葉系幹細胞; 臍帯; 骨再生

申請者は名古屋大学倫理委員会の承認を受けて、産婦人科学講座の協力をもとに帝王切開及び正常分娩の臍帯の供給を受け、これまでに得られた臍帯から同時に３種類の細胞（WJMSC・血管内皮細胞・造血幹細胞）を分離培養することに成功した。採取した臍帯血を比重遠心にて単核球分画を分離したのち磁気細胞分離装置にてCD34陽性造血幹細胞を分離した。造血幹細胞は造血幹細胞増殖培地にて拡大培養を行い、フローサイトメーターによる細胞表面抗原の解析によってCD34陽性CD45弱陽性な造血幹細胞が採取できていることを確認した。血管内皮細胞は臍帯静脈の内面をトリプシン処理し採取したのち血管内皮増殖因子添加増殖培地にて拡大培養後、CD31陽性、CD45陰性の典型的な臍帯静脈由来血管内皮細胞が採取できていることを確認した。WJMSC粗分画は血管周囲の臍帯間質Wharton’s jelly をヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ処理したのち、細胞接着特性によって採取した。細胞増殖試験を行い、WJMSCの高い増殖能を確認した。WJMSCの多分化能に関しては、通常の分化誘導プロトコールにしたがって骨・軟骨・脂肪・神経細胞への分化能を確認した。さらにWJMSCの骨前駆細胞への分化能を解析した。UCMSCを骨分化誘導培地に50～100ng/ml のBMP-2を添加して１週間培養した結果、アルカリフォスファターゼ活性の有意な上昇を認めた。また骨分化誘導培地に100ng/ml のBMP-2を添加して培養した結果、骨前駆細胞マーカー遺伝子であるRUNX2, Osteocalcinが発現することがわかった。よって骨分化誘導培地にBMP-2を添加することによってWJMSCを短期間で骨前駆細胞に分化誘導させることができることがわかった。

The applicant has successfully isolated and cultured three types of cells (WJMSC, vascular endothelial cells and hematopoietic stem cells) in cooperation with the Ethics Committee of Nagoya University for the purpose of receiving and providing information on the umbilical cord for normal labor. CD34-positive hematopoietic stem cells were isolated by magnetic cell separation device. Hematopoietic stem cells are cultured in large quantities, and CD34-positive CD45-weakly positive hematopoietic stem cells are analyzed. The vascular endothelial cells from umbilical vein were cultured in vitro and CD31 positive and CD45 negative vascular endothelial cells from umbilical vein were identified. WJMSC roughly divided the vascular tissue and umbilical interstitial Wharton's jelly into two parts: the first part is the blood vessel, the second part is the umbilical interstitial Wharton's jelly, the third part is the umbilical interstitial Wharton's jelly, the fourth part is the umbilical interstitial Wharton's jelly. Cell proliferation tests were conducted to confirm WJMSC's high level of proliferation. WJMSC's ability to differentiate into bone, cartilage, fat, and nerve cells was confirmed. The differentiation ability of WJMSC cells was analyzed. UCMSC induced bone differentiation by adding BMP-2 at 50~100ng/ml for 1 week. Bone differentiation was induced by adding BMP-2 at 100ng/ml to culture medium, and Osteocalcin was detected in Osteocalcin cells. BMP-2 was added to the culture medium to induce bone differentiation in WJMSC in a short time.