ナノポーラス金アクチュエータを使った細胞集団の機械的刺激感知機序の解明

ナノポーラス (np) 金アクチュエータを用いてヒト線維芽細胞シートに周期引張刺激を負荷した。ウエスタンブロッティング(WB)とリアルタイムPCR(RT-PCR)により、機械的刺激感知に関連するマップキナーゼ(MAPK)経路、細胞―細胞間結合のカドヘリンーカテニン複合体等の細胞内シグナル伝達経路のシグナルタンパク質と遺伝子発現量を定量化する環境を整え、実験を進めつつある。また、先の予定であった、細胞シート以外の細胞集団であるオルガノイドについても前倒しして作製条件を検討した。間葉系幹細胞・血管内皮細胞・線維芽細胞を標準的なプロトコルで培養し、これらを適切な比率で配合することで、直径100マイクロメートル程度の細胞凝集体を作製できることがわかった。この細胞凝集体を原材料としてオルガノイドを作製するプロトコルを調べている。この過程で試行的に作製されたオルガノイド内部を3次元免疫蛍光標識法により観察すると、血管内皮細胞が毛細血管網を形成していることが確認された。また、RT-PCR解析により、この試行サンプル中で間葉系幹細胞の肝分化が良好に進んでいることがわかった。なお、実験の優先度を再考し、当初予定にあった、牽引力顕微法 (TFM法) と蛍光共鳴エネルギー移動法 (FRET法) によりヒト線維芽細胞シートが受ける応力の分布状態を定量的に調べる、という実施内容は先送りした。そのほか、細胞シートを原材料とし、高密度細胞組織を作製することを試みた。毛細血管ネットワークを有した細胞シートを原材料として用い、かつ組織中央に人工的に流路を設けた場合、生細胞率が最も高かった。

ナノポーラス (np) 金アクチュエータを用いてヒト線維芽細胞シートに周期引張刺激を負荷した。ウエスタンブロッティング(WB)とリアルタイムPCR(RT-PCR)により、機械的刺激感知に関連するマップキナーゼ(MAPK)経路、細胞―細胞間結合のカドヘリンーカテニン複合体等の細胞内シグナル伝達経路のシグナルタンパク質と遺伝子発現量を定量化する環境を整え、実験を進めつつある。また、先の予定であった、細胞シート以外の細胞集団であるオルガノイドについても前倒しして作製条件を検討した。間葉系幹細胞・血管内皮細胞・線維芽細胞を標準的なプロトコルで培養し、これらを適切な比率で配合することで、直径100マイクロメートル程度の細胞凝集体を作製できることがわかった。この細胞凝集体を原材料としてオルガノイドを作製するプロトコルを調べている。この過程で試行的に作製されたオルガノイド内部を3次元免疫蛍光標識法により観察すると、血管内皮細胞が毛細血管網を形成していることが確認された。また、RT-PCR解析により、この試行サンプル中で間葉系幹細胞の肝分化が良好に進んでいることがわかった。なお、実験の優先度を再考し、当初予定にあった、牽引力顕微法 (TFM法) と蛍光共鳴エネルギー移動法 (FRET法) によりヒト線維芽細胞シートが受ける応力の分布状態を定量的に調べる、という実施内容は先送りした。そのほか、細胞シートを原材料とし、高密度細胞組織を作製することを試みた。毛細血管ネットワークを有した細胞シートを原材料として用い、かつ組織中央に人工的に流路を設けた場合、生細胞率が最も高かった。