完全な定量真度を有したddPCR分析法の確立

完全定量准确的ddPCR分析方法的建立

• 批准号: 22H02110
• 负责人: 橋本 雅彦
• 金额: $ 11.07万
• 依托单位: Doshisha University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02110/
• 关键词: ドロップレット; デジタルPCR; マイクロフルイディクス; ドロップレットデジタルPCR; マイクロ流体デバイス; ド ロップレット・デジタルPCR (ddPCR)

ドロップレットデジタルPCR(Droplet Digital PCR; ddPCR)は、リアルタイム定量PCRと比べて、検出感度と定量精度に優れるが、原因不明のレインドロップレットが発生してしまうため、完全な定量真度を有した定量PCR法とは成りえていない。レインドロップレット発生因の一つとして、ddPCR実験の操作工程におけるドロップレットの単分散性の低下が指摘されている。この単分散性の低下の主要な要因は、マイクロピペットを用いたマニュアル的なドロップレットのハンドリングにある。そこで本研究では、まずddPCRにおけるマニュアル的なドロップレットのハンドリングを必要としないマイクロ流体カートリッジを新たに作製した。上記のマイクロ流体カートリッジは、ドロップレット調製用のポリジメチルシロキサン（PDMS）製マイクロ流体シートであるトップレイヤー、および、ポリカーボネート製シートと薄板ガラス(厚み0.145 mm)を粘着フィルムでアッセンブルした反応チャンバーを有するボトムレイヤーより構成されている。トップレイヤーで生成したドロップレットはオンラインでボトムレイヤーに運ばれ、ガラス基板上にて単層となり広がった。この状態でフラットベッド型PCRサーマルサイクラーへカートリッジを設置しPCR増幅を行った。PCR増幅後にカートリッジを顕微鏡のステージに設置し、蛍光イメージングを行った。得られた蛍光画像には蛍光オンと蛍光オフのドロップレットが観察された。蛍光オンのドロップレットの割合を調べ、ポアソン回帰より予測されるDNAのコピー数を見積もったところ、調製時に加えたコピー数と良好な一致を示した。以上のように、開発したマイクロ流体カートリッジを使ってドロップレットのマニュアルハンドリングを必要としないddPCR実験を実行可能であることが示された。

Youdaoplaceholder0 PCR(Droplet Digital PCR; DdPCR) は, リ ア ル タ イ ム quantitative PCR と than べ て, 検 sensitivity と quantitative accuracy に optimal れ る が, unexplained の レ イ ン ド ロ ッ プ レ ッ ト が 発 raw し て し ま う た め, completely な quantitative degree of を し た quantitative PCR method と は into り え て い な い. レ イ ン ド ロ ッ プ レ ッ ト 発 bare for の つ と し て, ddPCR be 験 の engineering operation に お け る ド ロ ッ プ レ ッ ト の 単 low dispersion の が blame さ れ て い る. Main な こ の 単 low dispersion の の by は, マ イ ク ロ ピ ペ ッ ト を with い た マ ニ ュ ア ル of な ド ロ ッ プ レ ッ ト の ハ ン ド リ ン グ に あ る. そ こ で this study で は, ま ず ddPCR に お け る マ ニ ュ ア ル of な ド ロ ッ プ レ ッ ト の ハ ン ド リ ン グ を necessary と し な い マ イ ク ロ fluid カ ー ト リ ッ ジ を new た に cropping し た. Written の マ イ ク ロ fluid カ ー ト リ ッ ジ は, ド ロ ッ プ レ ッ ト modulation with の ポ リ ジ メ チ ル シ ロ キ サ ン (PDMS) system マ イ ク ロ fluid シ ー ト で あ る ト ッ プ レ イ ヤ ー, お よ び, ポ リ カ ー ボ ネ ー ト system シ ー ト と sheet ガ ラ ス (thick み 0.145 Mm) を adhesive フ ィ ル ム で ア ッ セ ン ブ ル し た anti 応 チ ャ ン バ ー を have す る ボ ト ム レ イ ヤ ー よ り constitute さ れ て い る. ト ッ プ レ イ ヤ ー で generated し た ド ロ ッ プ レ ッ ト は オ ン ラ イ ン で ボ ト ム レ イ ヤ ー に luck ば れ, ガ ラ ス substrate に て 単 layer と な り hiroo が っ た. The <s:1> <s:1> state でフラットベッド type PCRサ サ サ ラ サ サ サ サ サ サ サ ラ へカ トリッジを トリッジを トリッジを set the increment of the <s:1> PCR を row った. After PCR rights of に カ ー ト リ ッ ジ を 顕 micromirror の ス テ ー ジ に set し 蛍 light イ メ ー ジ ン グ を line っ た. The られた蛍 light image に 蛍 蛍 light <s:1> と蛍 と蛍 light フ フ ドロップレットが観 ドロップレットが観 observe された. 蛍 light オ ン の ド ロ ッ プ レ ッ ト の cut を adjustable べ, ポ ア ソ ン back 帰 よ り be さ れ る DNA の コ ピ ー number を see product も っ た と こ ろ, when modulation に え た コ ピ ー consistent in good と な を shown し た. Above の よ う に, open 発 し た マ イ ク ロ fluid カ ー ト リ ッ ジ を make っ て ド ロ ッ プ レ ッ ト の マ ニ ュ ア ル ハ ン ド リ ン グ を necessary と し な い ddPCR be 験 を may be line で あ る こ と が shown さ れ た.

项目成果

ddPCR分析を目的としたマイクロ流体カートリッジの開発

开发用于 ddPCR 分析的微流体盒

• 发表时间: 2022
• 作者: Umegaki Izumi;Ohishi Kazuki;Nakano Takehito;Nishimura Shoichiro;Takeshita Soshi;Koda Akihiro;Ninomiya Kazuhiko;Kubo M. Kenya;Sugiyama Jun;山本 志将，橋本 雅彦
• 通讯作者: 山本 志将，橋本 雅彦

PDMS製マイクロ流体チップの特性を活かしたポンプレスドロップレット調製法

利用PDMS微流控芯片特性的无泵液滴制备方法

• 发表时间: 2022
• 作者: 邱奕寰;武田伸一郎;大澤崇人;桂川美穂 ;南喬博 ;長澤 俊作 ;高橋忠幸 ;渡辺伸;谷口秋洋;水本和美;齋藤努; 久保謙哉;浅利駿介;反保元伸;梅垣いづみ;竹下聡史; 三宅康博;下村浩一郎;二宮和彦;太田 和孝，橋本 雅彦
• 通讯作者: 太田 和孝，橋本 雅彦

ポンプレスドロップレットチップの開発

无泵液滴芯片的研制

• 发表时间: 2022
• 作者: Kumi. Y. Inoue;Tomoki Iwama;Koki Kubota;Ryusei Naganuma;Hitoshi Shiku;橋本 雅彦
• 通讯作者: 橋本 雅彦

Rapid Fabrication of a Pumpless PDMS Microfluidic Device Using CO2 Laser Micromachining for Automated Formation of Monodisperse Water-in-Oil Droplets

使用 CO2 激光微加工快速制造无泵 PDMS 微流体装置，自动形成单分散油包水液滴

• DOI: 10.1246/cl.210566
• 发表时间: 2022
• 期刊: Chemistry Letters
• 影响因子: 1.6
• 作者: Okayama Shotaro;Nakatani Masaya;Hashimoto Masahiko
• 通讯作者: Hashimoto Masahiko

LDR に基づくメチル化DNA の選択的検出アッセイの確立

基于LDR的甲基化DNA选择性检测方法的建立

• 发表时间: 2022
• 作者: I-Huan Chiu;Kentaro Terada;Osawa Takahito;Changkun Park;Soshi Takeshita;Yasuhiro Miyake;and Kazuhiko Ninomiya;阿部岳晃，岩間智紀，小松万葉，久保田恒喜，遠藤彩音，戸塚友里，珠玖 仁，井上（安田）久美;市川菜摘・人見穣・小寺政人;塩飽恵也，橋本雅彦
• 通讯作者: 塩飽恵也，橋本雅彦