完全な定量真度を有したddPCR分析法の確立

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ドロップレットデジタルPCR(Droplet Digital PCR; ddPCR)は、リアルタイム定量PCRと比べて、検出感度と定量精度に優れるが、原因不明のレインドロップレットが発生してしまうため、完全な定量真度を有した定量PCR法とは成りえていない。レインドロップレット発生因の一つとして、ddPCR実験の操作工程におけるドロップレットの単分散性の低下が指摘されている。この単分散性の低下の主要な要因は、マイクロピペットを用いたマニュアル的なドロップレットのハンドリングにある。そこで本研究では、まずddPCRにおけるマニュアル的なドロップレットのハンドリングを必要としないマイクロ流体カートリッジを新たに作製した。上記のマイクロ流体カートリッジは、ドロップレット調製用のポリジメチルシロキサン（PDMS）製マイクロ流体シートであるトップレイヤー、および、ポリカーボネート製シートと薄板ガラス(厚み0.145 mm)を粘着フィルムでアッセンブルした反応チャンバーを有するボトムレイヤーより構成されている。トップレイヤーで生成したドロップレットはオンラインでボトムレイヤーに運ばれ、ガラス基板上にて単層となり広がった。この状態でフラットベッド型PCRサーマルサイクラーへカートリッジを設置しPCR増幅を行った。PCR増幅後にカートリッジを顕微鏡のステージに設置し、蛍光イメージングを行った。得られた蛍光画像には蛍光オンと蛍光オフのドロップレットが観察された。蛍光オンのドロップレットの割合を調べ、ポアソン回帰より予測されるDNAのコピー数を見積もったところ、調製時に加えたコピー数と良好な一致を示した。以上のように、開発したマイクロ流体カートリッジを使ってドロップレットのマニュアルハンドリングを必要としないddPCR実験を実行可能であることが示された。