ヒトに特有な希少RNA修飾の分子・生理機能の探求

動物組織のヌクレオシド分析から見いだされた新規修飾構造Xは、高等真核生物からのみ検出される点で本研究に適した対象と言える。培地に添加したCD3-メチオニンにより培養細胞中のXの質量が6Da増加したことから、S-アデノシルメチオニンを介して酵素的にジメチル化される生合成様式が示唆された。一方、Xの前駆体となるモノメチル化体Yの非酵素的な転移反応が中間経路で必要とも推測された。そこで組み換えタンパク質として取得したYの修飾酵素を用いて、T7転写反応で合成した細胞質tRNAを基質にメチル化反応させYを導入し、非酵素的な転移反応の実施後に、2回目のメチル化反応をすることで、Yの導入部位にXが新たに生じる結果を得た。また15N標識化合物による核酸塩基N原子の選択的標識とその追跡により、細胞内在のXが転移反応を経て形成されることを実証した。天然tRNA中からXを探索したところ、細胞質の成熟tRNAよりも核質内のtRNA前駆体においてXが強く検出されたことから、Xを持つtRNAは成熟の過程で分解されやすいか、脱メチル化反応によりYに戻るといった量的な調節を受ける機構が示唆された。修飾Xの機能の理解に向けて、環境変化に対する応答として細胞中のXの量が変動する可能性を探索した。転移反応の反応機構から、培養細胞内のpH上昇がXの形成を促進すると考えられたため、大気下(低い%CO2条件)の静置で培地のpHが経時的に上昇する性質に基づき、HEK293T細胞を大気条件下で培養し、Xの含有量をLC/MSで測定したところ、5%CO2で培地pHを中性付近で安定させる汎用的な培養環境条件と比べ、24時間の培養の間にXのシグナル強度が経時的に上昇する傾向が見いだされた。

動物組織のヌクレオシド分析から見いだされた新規修飾構造Xは、高等真核生物からのみ検出される点で本研究に適した対象と言える。培地に添加したCD3-メチオニンにより培養細胞中のXの質量が6Da増加したことから、S-アデノシルメチオニンを介して酵素的にジメチル化される生合成様式が示唆された。一方、Xの前駆体となるモノメチル化体Yの非酵素的な転移反応が中間経路で必要とも推測された。そこで組み換えタンパク質として取得したYの修飾酵素を用いて、T7転写反応で合成した細胞質tRNAを基質にメチル化反応させYを導入し、非酵素的な転移反応の実施後に、2回目のメチル化反応をすることで、Yの導入部位にXが新たに生じる結果を得た。また15N標識化合物による核酸塩基N原子の選択的標識とその追跡により、細胞内在のXが転移反応を経て形成されることを実証した。天然tRNA中からXを探索したところ、細胞質の成熟tRNAよりも核質内のtRNA前駆体においてXが強く検出されたことから、Xを持つtRNAは成熟の過程で分解されやすいか、脱メチル化反応によりYに戻るといった量的な調節を受ける機構が示唆された。修飾Xの機能の理解に向けて、環境変化に対する応答として細胞中のXの量が変動する可能性を探索した。転移反応の反応機構から、培養細胞内のpH上昇がXの形成を促進すると考えられたため、大気下(低い%CO2条件)の静置で培地のpHが経時的に上昇する性質に基づき、HEK293T細胞を大気条件下で培養し、Xの含有量をLC/MSで測定したところ、5%CO2で培地pHを中性付近で安定させる汎用的な培養環境条件と比べ、24時間の培養の間にXのシグナル強度が経時的に上昇する傾向が見いだされた。