Production of virus infection-resistant animals by a simple genome editing procedure

従来の装置を用いず、溶液に暴露するだけでCRISPR/Cas9系を受精卵に導入できる簡便なゲノム操作法について、暴露溶液に用いる導入原理の異なるトランスフェクション試薬を検討し、選択した試薬に応じた高効率なゲノム編集技術の確立を目指した。本年度は、3つの非ウイルスベクター導入試薬（脂質ナノ粒子、非リポソームポリマー、ペプチドシステム）を用いて、リボ核タンパク質複合体（RNP）の導入効率を比較した。ブタの透明帯フリーの接合体および胚を、Cas9、GGTA1を標的とするガイドRNA（gRNA）、および導入試薬のうち1つと5時間培養した。Cas9タンパク質とgRNAのモル比1：2、2：2、4：2とし、１倍量または２倍量の導入試薬を用い、体外受精（IVF）後10時間目の接合体に対して実施した。次に、体外受精後10時間目または29時間目の時点での、最適なモル比と導入試薬量を用いて導入時期を検討した。さらに、体外受精後10時間および29時間目の各試薬に応じた最適編集時期での組み合わせを検討した。各実験において、胚盤胞形成率および変異率を解析した。その結果、Cas9タンパク質：gRNAのモル比を4：2とし、試薬を2倍量添加することで、RNPを効率よく接合子にトランスフェクションすることができたが、接合子の胚盤胞形成率は低下する傾向にあった。また、最適な導入時間は試薬によって異なった。試薬の組み合わせにおける変異率は、試薬の種類にもよるが、単一試薬を介したトランスフェクションに比べて改善された。以上のことから、試験した各試薬において、いずれも発生した胚盤胞に変異を導入できるが、変異効率や胚発育の改善が必要と考えられた。

従来の装置を用いず、溶液に暴露するだけでCRISPR/Cas9系を受精卵に導入できる簡便なゲノム操作法について、暴露溶液に用いる導入原理の異なるトランスフェクション試薬を検討し、選択した試薬に応じた高効率なゲノム編集技術の確立を目指した。本年度は、3つの非ウイルスベクター導入試薬（脂質ナノ粒子、非リポソームポリマー、ペプチドシステム）を用いて、リボ核タンパク質複合体（RNP）の導入効率を比較した。ブタの透明帯フリーの接合体および胚を、Cas9、GGTA1を標的とするガイドRNA（gRNA）、および導入試薬のうち1つと5時間培養した。Cas9タンパク質とgRNAのモル比1：2、2：2、4：2とし、１倍量または２倍量の導入試薬を用い、体外受精（IVF）後10時間目の接合体に対して実施した。次に、体外受精後10時間目または29時間目の時点での、最適なモル比と導入試薬量を用いて導入時期を検討した。さらに、体外受精後10時間および29時間目の各試薬に応じた最適編集時期での組み合わせを検討した。各実験において、胚盤胞形成率および変異率を解析した。その結果、Cas9タンパク質：gRNAのモル比を4：2とし、試薬を2倍量添加することで、RNPを効率よく接合子にトランスフェクションすることができたが、接合子の胚盤胞形成率は低下する傾向にあった。また、最適な導入時間は試薬によって異なった。試薬の組み合わせにおける変異率は、試薬の種類にもよるが、単一試薬を介したトランスフェクションに比べて改善された。以上のことから、試験した各試薬において、いずれも発生した胚盤胞に変異を導入できるが、変異効率や胚発育の改善が必要と考えられた。