Production of virus infection-resistant animals by a simple genome editing procedure

通过简单的基因组编辑程序生产抗病毒感染的动物

• 批准号: 22H02499
• 负责人: 音井 威重
• 金额: $ 11.07万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02499/
• 关键词: ゲノム編集; ブタ; トランスフェクション; 遺伝子改変動物; PRRS

従来の装置を用いず、溶液に暴露するだけでCRISPR/Cas9系を受精卵に導入できる簡便なゲノム操作法について、暴露溶液に用いる導入原理の異なるトランスフェクション試薬を検討し、選択した試薬に応じた高効率なゲノム編集技術の確立を目指した。本年度は、3つの非ウイルスベクター導入試薬（脂質ナノ粒子、非リポソームポリマー、ペプチドシステム）を用いて、リボ核タンパク質複合体（RNP）の導入効率を比較した。ブタの透明帯フリーの接合体および胚を、Cas9、GGTA1を標的とするガイドRNA（gRNA）、および導入試薬のうち1つと5時間培養した。Cas9タンパク質とgRNAのモル比1：2、2：2、4：2とし、１倍量または２倍量の導入試薬を用い、体外受精（IVF）後10時間目の接合体に対して実施した。次に、体外受精後10時間目または29時間目の時点での、最適なモル比と導入試薬量を用いて導入時期を検討した。さらに、体外受精後10時間および29時間目の各試薬に応じた最適編集時期での組み合わせを検討した。各実験において、胚盤胞形成率および変異率を解析した。その結果、Cas9タンパク質：gRNAのモル比を4：2とし、試薬を2倍量添加することで、RNPを効率よく接合子にトランスフェクションすることができたが、接合子の胚盤胞形成率は低下する傾向にあった。また、最適な導入時間は試薬によって異なった。試薬の組み合わせにおける変異率は、試薬の種類にもよるが、単一試薬を介したトランスフェクションに比べて改善された。以上のことから、試験した各試薬において、いずれも発生した胚盤胞に変異を導入できるが、変異効率や胚発育の改善が必要と考えられた。

従 to の device を い ず, solution に exposure す る だ け で CRISPR/Cas9 を fertilized egg に import で き る simple な ゲ ノ ム operation に つ い て, exposed solution に い る import principle の different な る ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン try 薬 を beg し 検, sentaku し た try 薬 に 応 じ た high working rate な ゲ ノ compiling technology ム の establish を refers し た. は this year, 3 つ の non ウ イ ル ス ベ ク タ ー import try 薬 (lipid ナ ノ particles, non リ ポ ソ ー ム ポ リ マ ー, ペ プ チ ド シ ス テ ム) を with い て, リ ボ nuclear タ ン パ ク qualitative complex (RNP) の import を sharper rate comparison し た. ブ タ の transparent 帯 フ リ ー の gametes お よ び を, Cas9, GGTA1 を mark と す る ガ イ ド RNA (gRNA), お よ び import try 薬 の う ち 1 つ と 5 time cultivating し た. Cas9 タ ン パ ク qualitative と gRNA の モ ル than 2-1, 2-2, 4-2 と し, 1 times the amount of ま た は 2 times the amount of の import try 薬 を い, 10 time after in vitro fertilization (IVF) mesh の gametes に し seaborne て be applied し た. に, 10 time after in vitro fertilization (ivf) mesh ま た は 29 time mesh の point で の, optimum な モ ル than と import with 薬 quantity を い て import period を beg し 検 た. Youdaoplaceholder0, 10 time after in vitro fertilization および29 time period of each drug に応じた optimal compilation period で み group み わせを検 わせを検 discussion on た た. Each experiment にお て て, blastocyst formation rate および variation rate を analysis た た. そ の results, Cas9 タ ン パ ク mass: gRNA の モ ル than を 4-2 と し, try 薬 を 2 times the amount of added す る こ と で, RNP を sharper rate よ く zygote に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン す る こ と が で き た が, zygote の は blastoderm cell formation rate is low す る tendency に あ っ た. Youdaoplaceholder0, the optimal introduction time of な, the drug によって is different from なった. Try 薬 の group み close わ せ に お け る は - different rate, try 薬 の kinds に も よ る が, 単 try 薬 を interface し た ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン に than べ て improve さ れ た. Above の こ と か ら, test し た each try 薬 に お い て, い ず れ も 発 raw し た blastoderm cell に - different を import で き る が, - different working rate や embryo 発 の improve が と necessary test え ら れ た.

项目成果

Porcine embryo development and inactivation of microorganisms after ultraviolet-C irradiation at 228?nm

228 nm 紫外-C 照射后猪胚胎发育和微生物灭活

• DOI: 10.1016/j.theriogenology.2022.12.015
• 发表时间: 2023
• 期刊: Theriogenology
• 影响因子: 2.8
• 作者: Lin Qingyi;Aihara Mutsumi;Shirai Akihiro;Tanaka Ami;Takebayashi Koki;Yoshimura Naoaki;Torigoe Nanaka;Nagahara Megumi;Minamikawa Takeo;Otoi Takeshige
• 通讯作者: Otoi Takeshige

Triple gene editing in porcine embryos using a combination of microinjection, electroporation, and transfection methods.

结合显微注射、电穿孔和转染方法对猪胚胎进行三重基因编辑。

• 发表时间: 2022
• 作者: Lin Q;Le Q.A.;Wittayarat M;Namula Z;Takebayashi K;Hirata M;Tanihara F;Do LTK;Otoi T.
• 通讯作者: Otoi T.

Short‐term preservation of porcine zygotes at ambient temperature using a chemically defined medium

使用化学成分确定的培养基在环境温度下短期保存猪受精卵

• DOI: 10.1111/asj.13711
• 发表时间: 2022
• 期刊: Animal Science Journal
• 影响因子: 2
• 作者: Lin Qingyi;Le Quynh Anh;Takebayashi Koki;Hirata Maki;Tanihara Fuminori;Sawamoto Osamu;Kikuchi Takeshi;Otoi Takeshige
• 通讯作者: Otoi Takeshige

Gene editing in porcine embryos using a combination of electroporation and transfection methods

结合电穿孔和转染方法对猪胚胎进行基因编辑

• DOI: 10.1111/rda.14184
• 发表时间: 2022
• 期刊: Reproduction in Domestic Animals
• 影响因子: 1.7
• 作者: Takebayashi Koki;Wittayarat Manita;Lin Qingyi;Hirata Maki;Yoshimura Naoaki;Torigoe Nanaka;Nagahara Megumi;Do Lanh Thi Kim;Tanihara Fuminori;Otoi Takeshige
• 通讯作者: Otoi Takeshige