Development of in situ SPA with wedge-shaped sample

楔形样品原位 SPA 的开发

• 批准号: 22H02559
• 负责人: 加藤 貴之
• 金额: $ 11.23万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02559/
• 关键词: 単粒子解析; 楔形試料; 細胞内単粒子解析; cryo-EM; FIB-SEM; クライオ電子顕微鏡; 単粒子解析法; 収束イオンビーム; FIB; in situ SPA

タンパク質は生命活動の根幹であり、タンパク質の機能異常は病気を引き起こす。また、ウイルスなどの病原体は特定のタンパク質に結合することで感染が開始されるため、タンパク質を知ることは病気の治療や創薬のおいて最も重要な要素である。近年の創薬は構造情報に基づいた"Structure based drug design"が主流である。そのため、自然な状態のタンパク質の構造情報を得る手法は創薬の基盤技術になり得る。一般的に創薬に用いることができる高分解能な構造情報は細胞内から精製されたタンパク質を用いられ、細胞内で今まさに機能しているタンパク質の構造情報を高分解能で得る方法は未だに確立していない。本研究では凍結させた細胞を収束イオンビーム（FIB）を用いて、楔形に切削し、十分に薄い場所のみをクライオ電子顕微鏡にて撮影し、単粒子解析法を用いて細胞内のタンパク質の構造を解析する方法を確立することを目的としている。FIBは試料を非常に薄く切削できるが、通常の方法では高分解能な情報を得るには不十分であるため、まず楔形試料の切削の条件を検討した。特に自動切削と組み合わせた場合の１試料の作成時間、FIB装置からクライオ電子顕微鏡まで移送する際の力学的な安定性の注意し、実験を行なった。標準サンプルである酵母を用いて楔形試料の作成を試みたところ、手前が厚く奥が薄い楔形の試料を作成することに成功したが、奥の薄い部分の厚さは一定ではなく、リアス式海岸のように不均一に削られることが確認された。そこで手前が薄く奥が厚い逆楔形にすると比較的均等に薄い試料を作成することができた。自動切削を使ってある程度の厚さまで削った後、手動で楔形を作成することで、８時間に7箇所程度の楔を作成することができた。

タンパク性は生性の根干であり, タンパク性の Function Abnormality は Disease 気をinducing きこす.また、ウイルスなどのpathogenはspecificのタンパク性にcombinationすることで infectionがstartされるため、タンパク性を知ることは Disease 気のtreatment and creation 薬のおいてThe most important element is である. In recent years, "Structure based drug design" has become a mainstream product based on structural information.そのため、Natural state のタンパクquality のstructural information をget る Technique はCreation 薬のBasic technology になり got る. General に成薬に用いることができるHighly decomposable energy なstructural informationはintracellular からrefined されたタンパクquality を用いられ, the intracellular function and structure information of the high decomposition energy of the cell have not been established yet. This research is based on the use of frozen cells, FIB (FIB), wedge-shaped cutting, and very thin places where electronics can be used Microscope imaging and single particle analysis methods are used to analyze the structure of intracellular substances and establish the purpose of the analysis. FIB's specimens are very thin and the cutting conditions are high, and the normal method is to use high-resolution energy and information to obtain the information that is not very thin, and the wedge-shaped specimens are to be cut under cutting conditions. The special automatic cutting and assembly of the occasion, the production time of the sample, and the use of the FIB device The イオelectronic micro-mirror is used to transfer the stability and stability of the する INTERNATIONAL mechanics. Standard サンプルであるYeast を is made with いて wedge-shaped sample のをtest みたところ, and hand-made thick くくが thin い wedge-shaped の sample を is made することにSuccessful したが, Oku のthin い part の thick さは certain ではなく, リアス Style Coast のようにUneven one に Cut られるこ とが confirmed された.そこでThe hand is thin and thick, the inverse wedge shape is equal and the thin sample is compared, and the sample is made. After automatic cutting, the thickness of the thickness will be reduced, and the manual cutting will be used to make the wedge shape, and the wedge shape will be made in 8 hours.

项目成果

Cryo-CLEM 法およびCryo-ET 法による糸状仮足先端の三次元構造観察

利用 Cryo-CLEM 和 Cryo-ET 方法观察丝状伪足尖端的三维结构

• 发表时间: 2022
• 作者: Miho Nakafukasako;Tomoya Higo;Yuki Gomibuchi;Hiroko Takazaki;Yusuke V. Morimoto,Takayuki Kato;Takuo Yasunaga
• 通讯作者: Takuo Yasunaga