クライオ電顕を用いた鉄錯体輸送体の基質認識と輸送機構の解明

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クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析法によってオオムギ由来の鉄錯体輸送体（Yellow stripe1; YS1）の立体構造を決定した。構造解析の結果、YS1はコレステロール類似物質（CHS: コレステロールヘミコハク酸）が仲介した二量体を形成していた。YS1プロトマー構造は基質結合に関わるコアドメインと二量体界面を形成する足場ドメインに分かれ、両ドメイン間にキャビティを形成していた。YS1がCHS依存的な二量体を形成することをサイズ排除クロマトグラフィーによって確認し、さらに蛍光を用いた熱変性解析によりCHSがYS1の熱安定性が向上することを確認した。次に、YS1と鉄錯体（ムギネ酸鉄; Fe-DMA）との複合体構造をクライオ電子顕微鏡単粒子解析法によって決定した。YS1は外向き開口構造を形成しており、Fe-DMAはキャビティ内の細胞外側近くの結合ポケットに結合していた。YS1は、鉄と結合したムギネ酸の骨格構造を認識していることを明らかにした。基質認識に関わる残基の変異体を作製した。放射性ラベルした鉄とムギネ酸との複合体の取り込みを昆虫細胞を用いたアッセイ系によって解析した結果、変異体で取り込み活性が失われ、構造解析で見られた相互作用が正しいことを証明した。さらに人為的なムギネ酸鉄類縁体（Fe-PDMA）との複合体構造も明らかにした。Fe-PDMAはFe-DMAと全く同じようにYS1と結合しており、PDMAがDMAの代替として働くことを示した。YS1は足場ドメインに対しコアドメインが剛体様に動いて、外向き開口から内向き開口構造に遷移することが示唆された。さらに、分子動力学計算によってキャビティ内の３つのアスパラギン酸残基のプロトン化が基質の輸送に必要な構造変化を引き起こすことを示した。