Elucidation of the catalytic mechanism of copper-containing nitrite reductase by the cooperation of experiment and calculation

实验与计算相结合阐明含铜亚硝酸还原酶的催化机理

• 批准号: 22H02565
• 负责人: 玉田 太郎
• 金额: $ 10.23万
• 依托单位: National Institutes for Quantum Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02565/
• 关键词: タンパク質; 立体構造; 中性子・X線; 量子化学計算; 窒素循環

脱窒過程において亜硝酸イオンを一酸化窒素に還元する反応を触媒する銅含有亜硝酸還元酵素（CuNIR）の触媒サイクルにおける主要経路上の複数の状態を、水素原子の直接観察に長け照射損傷の無いプローブである「中性子」を中核に据え、X線を相補的に組み合わせて高精度構造解析を実施する。さらに、実験構造との整合性を担保した量子化学計算により、各状態間を補完したCuNIRの反応機構の全容解明を目的としている。本年度は基質結合酸化型の構造解析をT1Cu認識に関与するシステイン残基（Cys135）をアラニンに置換したC135A変異体と基質である亜硝酸イオンとの複合状態で実施した。中性子回折データ収集を100K下で実施し、1.7Å分解能で処理した。引き続き、放射光施設において、中性子回折データを収集した同一結晶から1.0Å分解能でX線回折データを収集した。中性子とＸ線を相補的に組み合わせた構造精密化の結果、亜硝酸イオンは脱プロトン化した状態で存在しており、亜硝酸上で電子が局在化していることが観察された。この実験結果は量子化学計算結果と整合性が見られた。一方で、亜硝酸イオンの配位モードは温度の影響も受けることが知られているため、基質アナログとしてギ酸を結合した複合体の構造解析を室温下で収集した回折データ（中性子：1.9Å分解能、X線：1.2Å分解能）を用いて実施した結果、亜硝酸イオンの配位モードは実験条件由来ではなく反応中の一段階を示唆するものであった。この配位モードが安定であることは量子化学計算結果からも確認された。また、過年度に実施した休止状態酸化型の中性子/X線構造解析においてT2Cuに水酸化物イオンが配位することを確認していたが、水酸化物イオンの配位状態を量子化学計算で検証した結果、T2Cuの電子状態によって水酸化物イオンと水分子が交換していることを示唆するデータを得た。

De-asphyxiation process includes nitric acid, nitric acid, In addition, the structure and integrity of quantum chemistry calculation are guaranteed, and the state between them is completed. The whole content of CuNIR reaction mechanism is clarified. This year, the structural analysis of matrix-bound acidification type was carried out in the complex state of Cys135, Cys135 and Cys135. The average temperature of the sample is 100K, and the resolution is 1.7 K. In addition, the X-ray diffraction pattern of the same crystal can be obtained by using the X-ray diffraction pattern. In the middle of the X-ray phase, the composition of the structure is refined, and the state of the nitrate is changed. In the middle of the nitrate, the electron is changed. The results of quantum chemistry calculations are consistent. The structure analysis of the complex was carried out at room temperature, and the results showed that the coordination conditions of nitric acid were the first step in the reaction. The results of quantum chemical calculations were confirmed. The coordination state of T2Cu in the acidic form was confirmed by the structural analysis of T2Cu in the neutral/X-ray structure. The coordination state of T2Cu in the acidic form was verified by the quantum chemical calculation. The electronic state of T2Cu in the acidic form of T2Cu was demonstrated by the exchange of water molecules.

项目成果

電子伝達タンパク質の高分解能構造解析

电子传递蛋白的高分辨率结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 安達 友里子;金子 美華;加藤 幸成;禾 晃和;Shintomi Keishi;三島正規;玉田太郎
• 通讯作者: 玉田太郎