Elucidation of the catalytic mechanism of copper-containing nitrite reductase by the cooperation of experiment and calculation

脱窒過程において亜硝酸イオンを一酸化窒素に還元する反応を触媒する銅含有亜硝酸還元酵素（CuNIR）の触媒サイクルにおける主要経路上の複数の状態を、水素原子の直接観察に長け照射損傷の無いプローブである「中性子」を中核に据え、X線を相補的に組み合わせて高精度構造解析を実施する。さらに、実験構造との整合性を担保した量子化学計算により、各状態間を補完したCuNIRの反応機構の全容解明を目的としている。本年度は基質結合酸化型の構造解析をT1Cu認識に関与するシステイン残基（Cys135）をアラニンに置換したC135A変異体と基質である亜硝酸イオンとの複合状態で実施した。中性子回折データ収集を100K下で実施し、1.7Å分解能で処理した。引き続き、放射光施設において、中性子回折データを収集した同一結晶から1.0Å分解能でX線回折データを収集した。中性子とＸ線を相補的に組み合わせた構造精密化の結果、亜硝酸イオンは脱プロトン化した状態で存在しており、亜硝酸上で電子が局在化していることが観察された。この実験結果は量子化学計算結果と整合性が見られた。一方で、亜硝酸イオンの配位モードは温度の影響も受けることが知られているため、基質アナログとしてギ酸を結合した複合体の構造解析を室温下で収集した回折データ（中性子：1.9Å分解能、X線：1.2Å分解能）を用いて実施した結果、亜硝酸イオンの配位モードは実験条件由来ではなく反応中の一段階を示唆するものであった。この配位モードが安定であることは量子化学計算結果からも確認された。また、過年度に実施した休止状態酸化型の中性子/X線構造解析においてT2Cuに水酸化物イオンが配位することを確認していたが、水酸化物イオンの配位状態を量子化学計算で検証した結果、T2Cuの電子状態によって水酸化物イオンと水分子が交換していることを示唆するデータを得た。

脱窒過程において亜硝酸イオンを一酸化窒素に還元する反応を触媒する銅含有亜硝酸還元酵素（CuNIR）の触媒サイクルにおける主要経路上の複数の状態を、水素原子の直接観察に長け照射損傷の無いプローブである「中性子」を中核に据え、X線を相補的に組み合わせて高精度構造解析を実施する。さらに、実験構造との整合性を担保した量子化学計算により、各状態間を補完したCuNIRの反応機構の全容解明を目的としている。本年度は基質結合酸化型の構造解析をT1Cu認識に関与するシステイン残基（Cys135）をアラニンに置換したC135A変異体と基質である亜硝酸イオンとの複合状態で実施した。中性子回折データ収集を100K下で実施し、1.7Å分解能で処理した。引き続き、放射光施設において、中性子回折データを収集した同一結晶から1.0Å分解能でX線回折データを収集した。中性子とＸ線を相補的に組み合わせた構造精密化の結果、亜硝酸イオンは脱プロトン化した状態で存在しており、亜硝酸上で電子が局在化していることが観察された。この実験結果は量子化学計算結果と整合性が見られた。一方で、亜硝酸イオンの配位モードは温度の影響も受けることが知られているため、基質アナログとしてギ酸を結合した複合体の構造解析を室温下で収集した回折データ（中性子：1.9Å分解能、X線：1.2Å分解能）を用いて実施した結果、亜硝酸イオンの配位モードは実験条件由来ではなく反応中の一段階を示唆するものであった。この配位モードが安定であることは量子化学計算結果からも確認された。また、過年度に実施した休止状態酸化型の中性子/X線構造解析においてT2Cuに水酸化物イオンが配位することを確認していたが、水酸化物イオンの配位状態を量子化学計算で検証した結果、T2Cuの電子状態によって水酸化物イオンと水分子が交換していることを示唆するデータを得た。