Regulatory modules for sperm cell differentiation and functioning in basal land plants and their evolution

研究項目１　DUO1およびRWP1のCitrine knock-in株から Citrine蛍光ポジティブの造精器を摘出し、ChIPseq解析をおこない、両転写因子が精細胞分化過程で結合しているゲノム上の領域に関する良質の知見を得た。変異体における発現解析の結果と合わせて、DUO1によるRWP1遺伝子の、RWP1による３つの精細胞特異的H1バリアント遺伝子の直接的な制御が強く支持された。DUO1とRWP1の一過発現アッセイ実験については、系そのものは機能しているが、ポジティブな結果を得ることができなかった。DUO1あるいはRWP1の他にも必要な因子があると考えられる。被子植物ではこれまで全く見落とされていたRWP1および精細胞特異的と考えられるH1バリアント遺伝子を見出し、変異体の作出に着手した。DN4MT1A,B遺伝子の完全欠失変異体の精細胞の透過型電子顕微鏡観察からは、同遺伝子の精子核凝縮における役割を支持する結果は得られなかった。精細胞特異的な small RNA経路に関しては、隣接して存在するMpPIWIA, MpPIWIB遺伝子、第６染色体に座乗するPHAS遺伝子座のそれぞれの完全欠失変異体の作出に着手した。研究項目２　KNOX1遺伝子座の逆鎖からの lnc RNA転写(SUK1)を介した発現抑制に関しては、SUK1プロモータ上のRWP1結合モチーフを欠失させた変異体を２株取得した。その後得られたRWP1のChIPseqデータから欠失領域が不十分であることが考えられたため、新たな欠失変異体の作出を進めている。関連して、DUO1依存の精細胞特異的な選択的スプライシングの制御に関して、RNAseqデータの検証、MBNL遺伝子の変異体作出、RWP1-Citrine knock-in株用いた精細胞分化期の造精器の Iso-seq解析のためのサンプリングなどをおこなった。

研究項目１　DUO1およびRWP1のCitrine knock-in株から Citrine蛍光ポジティブの造精器を摘出し、ChIPseq解析をおこない、両転写因子が精細胞分化過程で結合しているゲノム上の領域に関する良質の知見を得た。変異体における発現解析の結果と合わせて、DUO1によるRWP1遺伝子の、RWP1による３つの精細胞特異的H1バリアント遺伝子の直接的な制御が強く支持された。DUO1とRWP1の一過発現アッセイ実験については、系そのものは機能しているが、ポジティブな結果を得ることができなかった。DUO1あるいはRWP1の他にも必要な因子があると考えられる。被子植物ではこれまで全く見落とされていたRWP1および精細胞特異的と考えられるH1バリアント遺伝子を見出し、変異体の作出に着手した。DN4MT1A,B遺伝子の完全欠失変異体の精細胞の透過型電子顕微鏡観察からは、同遺伝子の精子核凝縮における役割を支持する結果は得られなかった。精細胞特異的な small RNA経路に関しては、隣接して存在するMpPIWIA, MpPIWIB遺伝子、第６染色体に座乗するPHAS遺伝子座のそれぞれの完全欠失変異体の作出に着手した。研究項目２　KNOX1遺伝子座の逆鎖からの lnc RNA転写(SUK1)を介した発現抑制に関しては、SUK1プロモータ上のRWP1結合モチーフを欠失させた変異体を２株取得した。その後得られたRWP1のChIPseqデータから欠失領域が不十分であることが考えられたため、新たな欠失変異体の作出を進めている。関連して、DUO1依存の精細胞特異的な選択的スプライシングの制御に関して、RNAseqデータの検証、MBNL遺伝子の変異体作出、RWP1-Citrine knock-in株用いた精細胞分化期の造精器の Iso-seq解析のためのサンプリングなどをおこなった。