Elucidation of the regulatory mechmisum of odontoblast differentiation by singl cell analysis and its application to therapeutics

单细胞分析阐明成牙本质细胞分化的调控机制及其在治疗中的应用

• 批准号: 22H03280
• 负责人: 大野 充昭
• 金额: $ 11.23万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H03280/
• 关键词: 象牙芽細胞; scRNA-seq; 転写因子; 再生; 1細胞解析

本研究では，歯科界において必須の情報でありながら未解決である象牙芽細胞マスター遺伝子の同定，さらにはダイレクトリプログラミングによる象牙芽細胞分化誘導法を確立する．具体的には，位置情報を付加した1細胞レベルでの解析に加えて，細胞分化の時間軸を加味した分化経 路推定解析を駆使し，候補転写因子群の抽出を行う．そして，iPS細胞樹立技術を逆手に取ったマスター遺伝子同定法を駆使して象牙芽細胞分化のマスター遺伝子を同定し，同定したマスター遺伝子や誘導した象牙芽細胞を利用して，象牙質再生療法の基盤技術を確立する事を目的としている．2022年度に，生後5~7日齢のCol1a1-GFPマウスの歯胚を摘出後，酵素処理により細胞の単一化を行った.GFP陽性象牙芽細胞およびGFP陽性骨芽 細胞が含まれる CD45 (白血球)，Ter119 (赤血球)，CD31 (血管内皮細胞)陰性分画に存在する細胞をセルソーターにて分離し，約5000個の単一細胞を得て，シングル解析システム (10x chromium)にてscRNA-seq解析を実施した.そして，細胞のアノテーションを行い，間葉系幹細胞が象牙芽細胞へと分化する過程を，velocity解析およびtrajectory解析を駆使し，解析した．その結果，歯胚に存在するMki67陽性の細胞増殖能が高い間葉系幹細胞を同定することができた．また，この細胞が，全象牙細胞から象牙芽細胞へと分化する過程を明らかにすることができた．今後，本結果から抽出された遺伝子に対し，機能解析を行う予定である．

This study provides essential information for dentistry to establish the identification of ivory bud cell differentiation, and to establish an ivory bud cell differentiation induction method. The specific position information is added to the analysis of cell differentiation, the Timeline of cell differentiation is added to the analysis of differentiation path estimation, and the extraction of candidate writing factor groups is carried out. In 2022, after the extraction of Col1a1-GFP from 5 to 7 days after birth, the development of iPS cell culture technology was successfully completed. Cell simplification is performed during enzyme treatment. GFP-positive ivory bud cells and GFP-positive bone bud cells contain CD45 (white blood cells), Ter119 (red blood cells), and CD31 (vascular endothelial cells). Cells present in the negative sections are separated completely and properly. Approximately 5000 single cells are obtained, and scRNA-seq analysis is performed on the CellArray Analysis System (10x chromium). In the process of differentiation of mesenchymal stem cells into ivory bud cells, velocity analysis and trajectory analysis are used to analyze the differentiation of mesenchymal stem cells into ivory bud cells. As a result, Mki67 positive cells were able to proliferate in vitro, and mesenchymal stem cells were able to proliferate in vitro. The process of differentiation of whole ivory cells from ivory bud cells to ivory bud cells is clear. In the future, the results of this study will be extracted from the database, and the function analysis will be determined.