Can a combination of cofactor-binding prediction and experimental validation identify uncharacterized enzymes?

本研究課題は、様々な生物種に多数存在する機能未知タンパク質の中から、特に未同定の酵素を明らかにすることを目的とし、酵素活性に必要な補因子の結合予測モデルの構築、および、結合予測モデルによって検出したタンパク質について、出芽酵母を実験モデルとした結合および細胞内代謝への関与を確認する実験を実施することを計画している。2022年度は、以下のことを行った。1. これまでに結合予測モデルを構築済みの補酵素（PLPとFAD）に加えて、NAD類似化合物の結合予測モデルを構築した。構築した結合予測モデルの予測精度を既存の結合予測法と比較し、高い精度で結合が予測できることを確認した。また、研究代表者が開発しているWebデータベース「Het-PDB Navi」上に結合予測モデルの実行インターフェースを実装し、Web上でPLPおよびFAD、NAD類似化合物の結合予測ができるようにした。2. PLP結合予測モデルによりPLP結合活性が予測された出芽酵母の機能未知タンパク質であるFmp41とYnl011cについて大腸菌で発現・精製を試みた。GST-Fmp41は精製でき、PLPとの結合活性を確認した。一方で、GST-Ynl011cは可溶化させることが困難であり、まだPLP結合活性を評価できていない。Fmp41については、PLPとの結合様式を明らかにするために、Fmp41-PLP複合体のX線結晶構造解析を行うこととした。そのために、Fmp41を大腸菌で過剰発現させ、アフィニティークロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。この精製タンパク質を結晶化実験に使用し、複数の条件で結晶ができることを確認した。3. Fmp41とYnl011cの細胞内代謝への関与を確認するために、栄養要求性等の変異をもたない酵母宿主を用いてFMP41とYNL011C遺伝子破壊株と過剰発現株を構築した。

本研究課題は、様々な生物種に多数存在する機能未知タンパク質の中から、特に未同定の酵素を明らかにすることを目的とし、酵素活性に必要な補因子の結合予測モデルの構築、および、結合予測モデルによって検出したタンパク質について、出芽酵母を実験モデルとした結合および細胞内代謝への関与を確認する実験を実施することを計画している。2022年度は、以下のことを行った。1. これまでに結合予測モデルを構築済みの補酵素（PLPとFAD）に加えて、NAD類似化合物の結合予測モデルを構築した。構築した結合予測モデルの予測精度を既存の結合予測法と比較し、高い精度で結合が予測できることを確認した。また、研究代表者が開発しているWebデータベース「Het-PDB Navi」上に結合予測モデルの実行インターフェースを実装し、Web上でPLPおよびFAD、NAD類似化合物の結合予測ができるようにした。2. PLP結合予測モデルによりPLP結合活性が予測された出芽酵母の機能未知タンパク質であるFmp41とYnl011cについて大腸菌で発現・精製を試みた。GST-Fmp41は精製でき、PLPとの結合活性を確認した。一方で、GST-Ynl011cは可溶化させることが困難であり、まだPLP結合活性を評価できていない。Fmp41については、PLPとの結合様式を明らかにするために、Fmp41-PLP複合体のX線結晶構造解析を行うこととした。そのために、Fmp41を大腸菌で過剰発現させ、アフィニティークロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。この精製タンパク質を結晶化実験に使用し、複数の条件で結晶ができることを確認した。3. Fmp41とYnl011cの細胞内代謝への関与を確認するために、栄養要求性等の変異をもたない酵母宿主を用いてFMP41とYNL011C遺伝子破壊株と過剰発現株を構築した。