二次性能動輸送タンパク質の共役イオン結合部位の構造の研究

本研究は、ほぼ計画通りに進行し、次の段階への足がかりができたと考えている。二次性能動輸送反応の機械論的メカニズムは、研究代表者が提案した逐次結合モデルにより説明されている。そのモデルでは、共役イオン結合にともなう輸送タンパク質のコンフォメーション変化を不可欠なものと考える。そこで、共役イオン結合部位の構造と、その結合に伴うタンパク質コンフォメーション変化の解明が必要となる。本研究では、まず大腸菌プロリン輸送タンパク質の共役イオン結合部位の構造について、Na^+が共役イオンである利点を活かし、各種変異およびその抑圧変異の解析から一次構造上の特徴を抽出することを主目的とした。1.これまでの大腸菌プロリン輸送タンパク質の研究によって得られた共役イオン結合についての変異タンパク質遺伝子に対し、亜硝酸処理によるランダム変異導入法を用いて、表現型を抑圧する変異を得た。2.それらの抑圧変異タンパク質遺伝子のDNA塩基配列を2株について決定し、変異部位を同定した。3.これら変異及び抑圧変異輸送タンパク質による輸送活性と基質結合活性を測定することにより、変異の性質を検討した。その結果、プロリン輸送タンパク質内でG22やC141は膜中央より外部に存在すると推定され、それが細胞外部での共役イオン結合に関わることが速度論的解析から示唆された。またR257は内部に存在すると推定され、その速度論的解析から、細胞内部でのNa^+結合に関わることが示唆された。このように、輸送反応モデルの各ステップの反応に関わるアミノ酸が、この研究を継続することにより明らかになってくると期待される。

本研究は、ほぼ計画通りに進行し、次の段階への足がかりができたと考えている。二次性能動輸送反応の機械論的メカニズムは、研究代表者が提案した逐次結合モデルにより説明されている。そのモデルでは、共役イオン結合にともなう輸送タンパク質のコンフォメーション変化を不可欠なものと考える。そこで、共役イオン結合部位の構造と、その結合に伴うタンパク質コンフォメーション変化の解明が必要となる。本研究では、まず大腸菌プロリン輸送タンパク質の共役イオン結合部位の構造について、Na^+が共役イオンである利点を活かし、各種変異およびその抑圧変異の解析から一次構造上の特徴を抽出することを主目的とした。1.これまでの大腸菌プロリン輸送タンパク質の研究によって得られた共役イオン結合についての変異タンパク質遺伝子に対し、亜硝酸処理によるランダム変異導入法を用いて、表現型を抑圧する変異を得た。2.それらの抑圧変異タンパク質遺伝子のDNA塩基配列を2株について決定し、変異部位を同定した。3.これら変異及び抑圧変異輸送タンパク質による輸送活性と基質結合活性を測定することにより、変異の性質を検討した。その結果、プロリン輸送タンパク質内でG22やC141は膜中央より外部に存在すると推定され、それが細胞外部での共役イオン結合に関わることが速度論的解析から示唆された。またR257は内部に存在すると推定され、その速度論的解析から、細胞内部でのNa^+結合に関わることが示唆された。このように、輸送反応モデルの各ステップの反応に関わるアミノ酸が、この研究を継続することにより明らかになってくると期待される。