C型慢性肝炎患者におけるB型肝炎ウイルス遺伝子の存在と発癌の関連

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1 肝生検時に保存された凍結肝組織をQIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)を用いてDNA抽出した(40検体)。2 研究開始当初は、既報の発表論文におけるPCR-sourthemhybndization法(S、X、C領域を各々PCRし、特異的なprobeでサザンブロッティング)でHBV DNAの存在の判定を行う予定で実験を進めていたが、実験系が複雑でコンタミネーションの可能性が高いことから、以下の実験方法を再検討した。(1)QuantiTect Custum Assay(QIAGEN)を用いてレポーター色素としてFAM(530nmで検出可能な蛍光)でラベルしたTaqManプローブを作成(S領域:S-Probe 460-476 TATGTTGCCCGTTTGTC、X領域:X-Probe 1582-1597 CACTTCGCTTCACCTC、C領域:C-Probe 2382-2397 CCTCGCCTCGCAGACG)。(2)LightCycler DX400(Rosh)systemでLightCycler反応ミックス(ライトサイクラー・ファーストスタート・DNAマスター・hybhdization Probes、Roshe)に上記probeと下記primer混入後、PCR施行(denature 1サイクル:95℃10分、50サイクル:変性95℃10秒、アニーリング・伸長60℃25秒、cooling 1サイクル:40℃30秒)。S領域:Primer 430-449 CTTCTTGTTGGTTCTTCTGG Reverse Primer 619-600 GGATGATGGGATGGGAATACX領域:Primer 1551-1568 GTCTGTGCCTTCTCATCT、Reverse Primer 1625-1608 GTTCACGGTGGTCTCCATC領域;Primer 2362-2379 GTCCCCTAGAAGAAGAAC、Reverse Primer 2479-2459 TTTCCCACCTTATGAGTCCAA3 感度の検討では、各領域でHBV DNAが30copies/tubeまで測定できる事と希釈列で良好な定量線が得られることを確認した。既報の発表論文におけるPCR-sourthemhybhdization法と感度で遜色のない事、さらにLightCycler DX400 systemがコンタミネーションの危険が少ない実験系であることから、今後の実験はLightCycler DX400 systemに変更して行うこととした。4 安定した実験系が確立して日が浅く、現在検討できたサンプル(約6検体)では、1検体でHBV DNA陽性を認めている。平成17年度は、抽出検体を当初予定の約200検体まで増やして、C型慢性肝炎患者におけるB型肝炎ウイルス遺伝子の存在と発癌の関連の検討を進めていく。